Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

Резюме

Описание процедуры количественного фосфорилирования использованием криодеструкция, мочевина solubilziation, HILIC фракционирования и IMAC обогащения фосфорилированных пептиды.

Аннотация

Этот протокол описывает роста и стимулирования, с жирной олеиновой кислоты, изотопно-тяжелой и легкой клетки С. CEREVISIAE. Клетки местности с помощью криодеструкции процедура в мясорубку шаровой мельнице и в результате grindate приведены в растворе мочевины солюбилизации. Эта процедура позволяет лизис клетки в метаболически неактивное состояние, сохраняя фосфорилирования и предотвращения переориентации phosphoproteome во время клеточного лизиса. После сокращения, алкилирования, трипсина переваривание белков, образцы обессоленной на C18 колонны и образец сложности сократились на фракционирования использованием гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC). HILIC колонн преимущественно сохраняют гидрофильных молекул, которые хорошо подходят для phosphoproteomics. Фосфорилированных пептиды, как правило, элюируются позднее в хроматографического профиля, чем не фосфорилированных аналогов. После фракционирования, фосфопептиды обогащенного использованием иммобилизованных металла хроматографии, которая опирается на заряд основе сродство к фосфопептидов обогащения. В конце этой процедуры образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии.

протокол

Клеточного роста и средств массовой информации

1. Единственная колония BY4742Δarg4Δlys1 клетки на ночь в 100 мл богатых СМИ OD ₆₀₀ на 1,0, то семя на две 1 л культур минимальной среде дрожжи (0,17% Дрожжи азотистого основания, без сульфата аммония или аминокислот, 0,5% сульфат аммония), содержащий полный набор аминокислот, дополнен 20 мг / л изотопически нормального или тяжелого аргинин ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) и лизина ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. Клетки выращивались в течение 18 часов, чтобы OD ₆₀₀ из 1,8. Очень важно, чтобы клетки пройти как минимум 9 поколений, чтобы добиться полного включения меченых изотопов. Свет образец осаждали, промывали стерильной водой, reseeded в олеат среде, содержащей (изотонически нормальной аргинин и лизин, 0,2% олеиновой кислоты (Sigma Chemicals) и 0,5% Твин 40 (Sigma Chemicals)) и стимулировали еще 85 минут. Это дает изотопно света, по отношению к аргинин и лизин, олеат-стимулированных образца и изотопно тяжелых глюкозы выращенных эталонного образца.

Лизиса клеток, выделения и фракционирования пептиды

3. Взвесьте центрифуги бутылку. Урожай образцы центрифугированием в течение 3 минут. Удалить СМИ и аспирации лишнюю жидкость. Взвесьте гранул и бутылки (как правило доходности между 1-2 грамма), то вспышка заморозить в жидком азоте. Добавить объеме, эквивалентном гранулы вес "шлифовка" буфер для замороженных гранул в жидком азоте (фосфатно-солевым буфером (PBS, Gibco), 10% глицерина, Ингибиторы протеазы (SigmaFAST Таблетки ингибитор протеазы, Sigma) и HALT фосфатазы ингибиторы (Thermo Scientific )).
4. Замораживание шлифовальные судна в жидком азоте. Подождите, пока жидкого азота перестает кипеть. Передача гранулы для шлифовальных судна, с замороженными шарикоподшипников.
5. Grind при 600 оборотах в минуту с 1 мин 20 сек цикл с направлением обращения в течение 3 минут. Замораживать шлифовальные судна в жидком азоте. Повторите 4 раза в течение 15 минут общего времени измельчения.
6. Сбор замороженных grindate в 50 мл Сокол трубки месте сухого льда. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию.
7. Сделать 10мл решение 8М мочевины, 0,1 М бикарбонат аммония, 0,1 М Трис рН 8,6. Добавить 3 объема мочевины буфера 1 объем замороженных grindate (например 3mls из мочевины буфера добавляется в 1 г гранул с 1 мл PBS буфера). Сразу же разрушать ультразвуком смеси с sonicator зонда (2 - 10 секунд импульсов). Держите наконечник в нижней части трубки для предотвращения вспенивания раствора. Grindate должны немедленно отправиться в раствор.
8. Очистить лизата центрифугированием в течение 5 минут при 4 ° C.
9. Передача супернатант на свежий труб.
10. Сделайте свежие аликвоту 0,5 М трис [2-карбоксиэтил] фосфин (TCEP). Добавить в образце при 1:100 для конечной концентрации 5 мМ. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч.
11. Алкилирование снижается цистеина. Дать остыть до комнатной температуры. Сделайте свежие аликвоту 1M iodoacetamide. Хранить в темноте (мы обернуть трубу в фольге). Добавить в конечной концентрации 20 мМ. Инкубировать в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре.
12. Quench iodoacetamide с 20 мМ DTT 1M от фондового при комнатной температуре в течение 1 ч.
13. Количественная белка со стандартным Брэдфорд или BCA анализа (не описаны). Возьмите образец для анализа с помощью SDS PAGE ниже.
14. Для проверки включения тяжелых изотопов, используйте 100 мкл снижается и алкилированные лизат. Развести 1:4 с дН ₂ O, разрушать ультразвуком и добавить в трипсин 50:1 белка трипсином. Дайджест в течение минимум 4 часов, сухой образец вниз в вакууме скорость, а затем опреснения с C18 столбцов Ultramicrospin (гнездо Group).
    1. Гидратов колонку с 100 мкл ацетонитрила
    2. Равновесие с 200 мкл 0,1% TFA.
    3. Ресуспендируют сухого образца в 200 мкл 0,1% TFA. Нагрузка на колонну. Центрифуга при температуре ~ 200 мкг или минимальной скорости, необходимые для потока через колонку.
    4. Промыть два раза с 200 мкл 0,1% TFA.
    5. Элюируются в два раза с 50 мкл 60% ацетонитрила, 0,1% TFA.
    6. Сухой образец в вакууме скорость.
    7. Ресуспендируют образца в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Выполните 2 мкл на масс-спектрометре. Проверьте включение изотопно тяжелых аргинин и лизин сдвигом 10 и 8 Далтон в соответствующих т / г спектров. Включения для каждой аминокислоты должны быть в пределах от 96 - 98%.
15. Смешайте эквивалентные суммы (мг белков) изотопически тяжелые и легкие образцы.
16. Разбавьте образцы 1:04 с 20% метанола.
17. Добавить трипсина на 1:200. Выдержите в течение ночи при температуре 37 ° C.
18. Убедитесь, что пищеварение отправился в завершение СТРАНИЦА SDS. Выполните 2 и 4 мкл предварительное переваривание образца и 8D 16 мкл сообщение трипсина переварить. Визуализируйте окрашиванием Кумасси, что пищеварение завершена. Если он не является полным, разрушать ультразвуком образца с sonicator кратко кончика зонда и переварить снова трипсином.
19. Сухой образец вниз в скорости вакцины. При сухой добавить 200 мкл с фильтром дН ₂ O и вихревые до гранул переходит в раствор. Сухой образец вниз в скорости вакцины. Ресуспендируют снова дН ₂ O. Сухой образец снова.
20. Ресуспендируют гранулы в 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ; Sigma). Убедитесь, что рН составляет около 3 с помощью рН полоски. При необходимости подкисляют 10% TFA.
21. Гранул из любой осадок.
22. Опреснения образцов на водах Sep-Pak Vac 500 мг C18 колонке. Не перегружайте этих столбцов. Максимальная сумма составляет 5 мг, но лучше, чтобы загрузить немного меньше. Разделить между образцом несколько столбцов, если необходимо.
    1. Гидратов колонки с 5 мл на 100% ацетонитрила. Центрифуга при температуре ~ 200 мкг или минимальной скорости, необходимые для потока через колонку.
    2. Равновесия колонка с 5 мл 0,1% TFA. Нагрузка образца. Сбор потока и загрузить снова.
    3. Промыть 5 мл 0,1% TFA. Повторить.
    4. Элюции с 2 мл 60% ацетонитрила, 0,1% TFA.
    5. Сухой образец вниз в скорости вакцины.

Пептидов Фракционирование и выделение фосфопептидов

1. Пептиды фракционируют на HILIC колонке. Мы используем Tosoh TSK-гель Амид-80 4,6 мм х 25 см аналитическую колонку с охраной колонке. Не торопитесь с этим шагом, запустить колонку в течение 2 часов при 90% запустить две пустые градиенты до загрузки вашего образца. Максимальная нагрузка на колонки такого размера, как считается, около XX, мы обычно не загружайте более 5 мг в перспективе.
2. Растворитель - 98% ACN/0.1% TFA
   Растворитель B - 2% ACN/0.1% TFA
   Нагрузка в 90% в течение 20 ', 90% до 85% в течение 5, 85% до 60% в течение 40', 60% до 0% в течение 5 ', 0% до 90% в течение 5 '.
3. Расход 1ml/min и фракций были собраны на 2 минуты интервалы, начиная с 85% до 60% градиент.
4. Комбинат фракций уменьшить количество фракций до 10. Увеличение фракций, скорее всего, принесет больше охват phosphoproteome.

Обогащение фосфопептидов

1. Фосфопептиды обогащенного использованием PHOS-Select Железный Affinity лари. Мы аликвоту нашей IMAC смолы, чтобы избежать повторного замораживания оттаивания. Сделайте 50 мл 250 мМ уксусной кислоты, 30% раствор АКС нагрузки. Довести рН до 2,7 с HCl. Ресуспендируют гранул в 500 мкл нагрузка решение. Проверьте рН, отрегулируйте с HCl или NaOH по мере необходимости.
2. Предварительная стирка 200 мкл IMAC бисером в соответствующую графу. Мы используем Molbiotec столбцов спина.
   Добавить 15 мкл 50% раствора (гель для загрузки раствора) в каждой фракции, и инкубировать образцы для 30 'с конца по конец вращения. Держите потока для анализа.
3. Вымойте образцы 3 раза с грузом решение и один раз с 500 мкл фильтруется дН ₂ O.
4. Элюции пептидов с 2 - 3 мин при 400 мкл 50 мМ Na ₂ HPO ₄ (рН 8,4) буфера. Трансфер в стеклянный пузырек.
5. Подкисляют до рН 3 с 5 мкл 100% муравьиной кислоты, флэш заморозить в жидком азоте, и высушенного образца вниз в скорости вакцины.
6. Ресуспендируют фосфопептидов в 200 мкл 0,1% TFA и C18 чист, как описано выше. Сухой вниз элюировали образцов в вакууме скорость.
7. Ресуспендируют пептидов в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Используйте 2 мкл на масс-спектрометре анализа или по мере необходимости.

Примечания

На протяжении большей части этого протокола вы будете работать «слепым». Лизиса клеток можно контролировать с помощью западных промокательной и Брэдфорда или BCA анализы, и пищеварение трипсина также может быть легко оценена. HILIC столбец дал след, подобный этому, или, как показано в других работах [1, 2] в зависимости от жидкой хроматографии машина, которая используется. Образцы контролируются масс-спектрометрии; тестирование образцов на недорогих машин, таких как LCQs или Мальдис перед отходом ко высокой анализ стоимости на высокой точностью массы, высокий машина разрешения. Наконец, если вы вниз сушки образца с кислотой в нем, использование стекла.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот метод даст обогащение фосфопептидов, которые могут быть количественный анализ. Число параметров может быть изменен в данном протоколе, но самый важный аспект помнить, чтобы сохранить свои фосфорилирования. Подготовка клеток для количественной может быть достигнуто в несколько р...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lysine-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid	Invitrogen	70011044
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Retsch PM100 Ball Mill Grinder	Retsch	20.540.0001
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar	Retsch	01.462.0148
Ultramicrospin C18 column	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column	Tosoh Corp.	13071	This is the HILIC chromatographic column.
Guard column 4.6 mm ID x1 cm	Tosoh Corp.	19021	We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel	Sigma-Aldrich	P9740	This is the IMAC resin. Aliquot and store.