Использование SC1 (Pluripotin) для поддержки мЭСК Самообновление в отсутствие LIF

Резюме

SC1 функции через двойное торможение Рас-GAP и ERK1. Мы протестировали функции SC1 в поддержке ЭСК мыши самообновление в отсутствие LIF и показал, что SC1 способен поддерживать самообновление мыши культур ЭСК.

Аннотация

Мышь эмбриональных стволовых (ЭС) клеток условно культивировали с подавления лейкоза фактор (LIF) для поддержания самообновления.

протокол

1. Подготовка пластин MEF подачи

1. За день до культивирования клетки ES, оттепель один флакон облученных E14.5 CF-1 MEF фидерных клеток (см. нашу процедуру о том, как оттепель ЭС клетки).
2. Пластина питателя MEF клетки при плотности 10000 клеток / лунку в 12-луночного планшета. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2. MEF ячейки СМИ: DMEM с добавлением 10% ES-би-эс, 1X 1X глютамин и не-незаменимых аминокислот.

2. Поддержание самообновления ЭС клетках мыши

1. Отсоедините ES клеток с использованием трипсина. Семенной клетки при плотности 50000 клеток / лунку на заранее подготовленные MEF подачи пластин в питательной среде (Knockout MEM дополнена с 15% КСР, 4 мМ L-глутамина, 0,1 ммоль без незаменимых аминокислот и 1X BME) с добавлением SC1 при требуемой концентрации (мы использовали 100 нм, 300 нм, и 1 мкМ). Мы также добавили положительный контрольный колодец, который был дополнен 1000 μ / мл LIF. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
2. Культуры клеток при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 3-4 дней в каждом проходе. Обновить СМИ каждые 48 часов.
3. Прохождение клетки 1:10 до 1:15 трипсином для поддержания одинаковой плотности, как начальная плотность посева. Через 5 пассажей, клетки могут быть проверены на предмет выражения типичных плюрипотентности маркеры, используя иммуноцитохимия.

3. Иммуноцитохимическая Экспертиза плюрипотентности Маркеры

1. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
2. Fix клеток с 500 мкл фиксатором в течение 20 минут при комнатной температуре.
3. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
4. Блок неспецифического связывания с 500 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре.
5. Инкубируйте клетки с 250 мкл конкретных первичных антител (мы использовали Nanog, Sox2, SSEA1 и Oct4 на следующие разведения: 1:500, 1:2000, 1:500 и 1:500)
6. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
7. Инкубируйте клетки с 250 мкл вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали осла антимышиным сопряженных с Alexa Fluor 555 ® на 1:2000 и осла анти-кролик сопряженных с Alexa Fluor ® 488 на 1 : 2000).
8. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
9. Добавить DAPI (конечная концентрация 1 мкг / мл) до последнего мыть и инкубировать 5 минут для визуализации ядер.
10. Анализ клеток под флуоресцентным микроскопом.

4. Представитель Результаты:

1. Морфология результаты:

ЭС клетки мыши (ESC R1) были выращены на MEF фидерных клеток в присутствии либо LIF или SC1 для поддержания самообновления в недифференцированное состояние. После второго прохода, дифференциации можно было наблюдать в клетках, не LIF или SC1 (отрицательный контроль) и после 5 проходов по сути, не недифференцированное колоний не наблюдалось. LIF (положительный контроль) рассматриваются колоний остались в недифференцированном состоянии на протяжении 5 проходов клетки. Клетки обрабатывали SC1 в концентрации 300 нМ или 100 нм также остается недифференцированной после 5 проходов, однако, клетки обрабатывали 1 мкМ SC1 опытных гибель клеток после четвертого прохода. (Рис 2 отметить приложение) В таблице 1 приведены морфологические наблюдения.

2. Экспрессия маркеров плюрипотентности

ЭС клетки мыши поддерживается в течение 5 проходы были зафиксированы и рассмотрены иммуноцитохимии для SSEA1, Oct4, Nanog и Sox2. Маркер выражении был похож на клетки сохраняются в LIF. (Рис. 3 и 4 записки приложение)

Рисунок 1: Морфология сравнению клеток поддерживается в LIF или SC1. Никаких различий в морфологии не наблюдалось.

Рисунок 2 и Рисунок 3: Nanog, SSEA1, Sox2, и Oct4 окрашивания ЭС клеток поддерживается с SC1 или LIF (рис. 4 записки приложение). Клетки поддерживается в SC1 показывают, что аналогичные выражения плюрипотентности маркер для клеток поддерживается в LIF.

Таблица 1

	Отрицательный контроль	LIF Положительный контроль	SC1 1 мкм	SC1 300 нМ	SC1 100 нМ
Прохождение первого	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES
Второй проход	Некоторые дифференцированной морфологии	Нормальная ES морфологии клеток	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES
Третий Прохождение	Большинство клеток дифференцированных	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES
Четвёртое Прохождение	Нет ESC колонии	Нормальная морфология ячейки ES	Гибель клеток наблюдается	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES
Прохождение пятой	дифференцированный	Нормальная морфология ячейки ES	Гибель клеток наблюдается	Нормальная морфология ячейки ES	Нормальная морфология ячейки ES

Обсуждение

Небольшой SC1 молекулы могут быть использованы для поддержания самообновления с недифференцированное состояние, в ЭС клетках мыши. Перед использованием на непроверенных клеточной линии, однако, следует титровать, чтобы определить оптимальную концентрацию. Например, мы протестировали три концентрации на мыши ES клеточной линии ЭСК R1. 100 нм и 300 нм концентрации были в состоянии поддерживать ЭС клетках мыши, однако, 1 мкМ концентрации токсичных.

SC1 также может быть использован под фидерных свободных условиях.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279