Репортер Роман ППП в помощь Визуализация глаз имагинальных дисков в Drosophila</em

Резюме

Мы описываем роман красный флуоресцентный белок (RFP) репортеру, что выражается в частности в Drosophila Глаза. Мы подробно методология рассечения глаз имагинальных дисков, и как это репортер может быть использована для помощи в вскрытие и идентификация специфических типов клеток в развивающемся глазу.

Аннотация

протокол

1. Первое место капля PBS на блюдо Sylgard при вскрытии микроскопом.
2. Далее удалить несколько блуждающих третьего возраста личинок из флакона или бутылки с помощью шпателя и поместите их в PBS.
3. Для начала вскрытия использовать левую пинцетом рукой (если вы правша), чтобы понять личинки две трети пути к задней, а затем использовать другую пару провести темные крючки рот на переднем конце.
4. Теперь осторожно потяните личинки, кроме, перемещая обе пары пинцетом друг от друга. Ротовые должны прийти от остальной части тела с глаз / мозга комплекс прилагается.
5. Для окраски глаз диски для иммунофлюоресценции исправить дисков на данный момент, поместив их в 4% параформальдегид / PBS решение в течение 30-45 минут на льду. Затем промыть дисков в четыре раза с PBST и пятна, то с соответствующими антителами.
6. Проще всего анализировать глаз диски прямо на слайде. Место падения ФСБ на предметное стекло и перемещать диски в капле PBS, удерживая ротовые.
7. Имагинальных ткани полупрозрачные и поэтому на первый взгляд диски трудно идентифицировать. Чтобы было легче идентифицировать их использование рассекает микроскопом с флуоресцентной способности. Использование глаз RFP репортер линии глаз диски хорошо видно, как красные флуоресцентные ткани наложения сферических оптических долях (рис. 1).
8. Если вы используете оптоволоконный источник холодного света направлять свет под косым углом к ​​слайду, так как это даст диски большего контраста. Глаз / усиков диски крепятся к оптической долями через глазной стебель на задней и ротовые через стебель ближайшие от усиков диск на переднем.
9. Чтобы рассечь глаз диски содержат ротовые используя один пинцет и использовать другую пару отделить глаз диски от личиночной мозга. Следующая отдельные глаз диски от ротового. Наконец удалить из ротового слайд так как они могут предотвратить покровное от лежа.
10. Если у вас есть расчлененный все диски глаз мягко наклона слайдов и высушить избыток PBS. Затем добавьте каплю Vectashield и осторожно положите покровное на вершине.
11. Диски готовы для включения в образ либо epifluorescence или конфокальной микроскопии (рис. 2).

Результаты представитель

Когда правильно расчлененные глаз / усиков диск должен лежать на слайд подальше от посторонних тканей, таких как мозг. Спинной и брюшной полюса глаза диск изогнуты и поэтому, как правило, раза, но этого можно избежать, приняв Z-серии по конфокальной микроскопии и опуская эти разделы с проекцией. Хотя диск однослойный эпителий переменная положений ядер требует Z-серии проекции, чтобы получить общее представление о диске. Проекция типичной для глаз RFP глаз / усиков диск приняты на конфокальной микроскопии показано на рисунке 2. Мы обычно принимают по 1 мкм срезы через диск с помощью 20x или 40x объектива. Глаза RFP репортер ядерной локализованы и поэтому картина показано на рисунке 2 представляет ядер клеток, экспрессирующих ППП.

Рисунок 1. Первоначальное вскрытие глаз / мозг комплекса из глаз RFP третьей взрослой личинки дрозофилы. Глаз / усиков имагинальных дисков (очерчен) можно увидеть придается ротовые (МП) и наложения оптической доли (ПР) головного мозга. Изображение было получено использованием флуоресценции рассекает микроскопом, чтобы показать, выражение ППП в глаза диска. Передняя находится слева. Шкала бар: 300 мкм.

Рисунок 2. Выражение глаз RFP репортером в глаза имагинальных дисков. Третий глаз возраста (ED) / усиков диск (AD), расчлененные от глаз ППП ППП личинки показывает выражение (красный). Диск был залит фаллоидином (зеленый), что пятна апикальной поверхности клеток и показывает морфогенетических борозды (стрелки). ППП выражается в клетки-предшественники вокруг М.Ф., в фоторецепторы 1,6,7 и колбочек. Передняя находится слева. Шкала бар: 25 мкм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Препарирование диска Drosophila глаз имагинальных прост, но может занять много времени для освоения. Критические шаги идентификации диска глаза и его рассечение от личиночной мозга. Определение глаз диск облегчается использованием глаз RFP линии описано здесь. Возможные модификации д?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.