Цыпленок Ех ово Культура и Ех ово CAM Пробирной: как это действительно работает

Резюме

Куриных chorioallantoic мембраны (CAM) является уникальным, естественно иммунодефицитных благоприятные условия для изучения культуры ангиогенеза и опухолей. Это видео статья демонстрирует различные этапы на куриных Ех ово Культура, применение потенциально ангиогенных веществ и успешной прививки опухолевых клеток и тканей на поверхности CAM.

Аннотация

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study angiogenesis but also to study tumorigenesis. After the chick chorioallantoic membrane (CAM) has developed, its blood vessel network can be easily accessed, manipulated and observed and therefore provides an optimal setting for angiogenesis assays. Since the lymphoid system is not fully developed until late stages of incubation, the chick embryo serves as a naturally immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition to nurturing developing allo- and xenografts, the CAM blood vessel network provides a uniquely supportive environment for tumor cell intravasation, dissemination, and vascular arrest and a repository where arrested cells extravasate to form micro metastatic foci.

For experimental purposes, in most of the recent studies the CAM was exposed by cutting a window through the egg shell and experiments were carried out in ovo, resulting in significant limitations in the accessibility of the CAM and possibilities for observation and photo documentation of effects. When shell-less cultures of the chick embryo were used^1-4, no experimental details were provided and, if published at all, the survival rates of these cultures were low. We refined the method of ex ovo culture of chick embryos significantly by introducing a rationally controlled extrusion of the egg content. These ex ovo cultures enhance the accessibility of the CAM and chick embryo, enabling easy in vivo documentation of effects and facilitating experimental manipulation of the embryo. This allows the successful application to a large number of scientific questions: (1) As an improved angiogenesis assay^5,6, (2) an experimental set up for facilitated injections in the vitreous of the chick embryo eye^7-9, (3) as a test environment for dissemination and intravasation of dispersed tumor cells from established cell lines inoculated on the CAM^10-12, (4) as an improved sustaining system for successful transplantation and culture of limb buds of chicken and mice¹³ as well as (5) for grafting, propagation, and re-grafting of solid primary tumor tissue obtained from biopsies on the surface of the CAM¹⁴.

In this video article we describe the establishment of a refined chick ex ovo culture and CAM assay with survival rates over 50%. Besides we provide a step by step demonstration of the successful application of the ex ovo culture for a large number of scientific applications.

Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, and Sebastian Gustmann contributed equally to this study.

протокол

Все оборудование и реагенты должны быть приобретены стерильные или должна быть тепла или пара стерилизации или стерилизуют 70% этанола.

Авторы утверждают, что эксперименты на животных были проведены в соответствии с Европейскими сообществами Директивы Совета (86/609/EEC), следующие руководящие принципы в отношении НИЗ уход и использование животных для экспериментальных процедур и правил, установленных Институциональные животных Уход и использование комитета (IACUC) в университете Дуйсбург-Эссен (Германия).

Часть 1: инкубация яиц

1. Оплодотворенные яйца можно хранить при температуре 13 ° С не более одной недели.
2. Яйца инкубируют в течение 72 часов, лежа горизонтально в инкубатор с движущейся лоток, вращающиеся яйца 12 раз в день непрерывно. Влажность поддерживают на уровне 60 - 62%, температуры инкубации при 37,5 ° C.
   Примечание: Перед началом инкубации, грязи, перья и экскременты осторожно удаляются с яичная скорлупа механически сухим вытирая с общими, серый зигзаг стороны бумажные полотенца, которые грубо, а не мягкую структуру поверхности. Вытирая яйца с этанолом или дезинфицирующим средством, однако, значительно снижается выживаемость эмбрионов, независимо от используемой жидкости.

Часть 2: Ex ово культуры

1. После инкубации в течение 72 часов, яйца удаляются из инкубатора.
   Примечание: яйца выдерживают в течение 72 часов, потому что - в соответствии с нашими экспериментами - по неизвестным причинам, но по согласованию с Ауэрбах и др.1 ранних стадиях развития, имели значительно более низкие показатели выживаемости. На этапах позднее чем через 72 часа желток мешок, который еще не покрыты CAM становится тоньше и имеет тенденцию придерживаться яичной скорлупы ведущих (я) до маленьких кровотечений в области присоединения и (II) разрыв желтка мешок мембраны. Поэтому данный способ не применим к эмбрионы старше 72 часов.
2. Верхняя часть яйца, где находится зародыш, отмечен карандашом поскольку эмбрион сопротивляется вращению в определенной степени.
3. Яйцо держится горизонтально с карандашом марки на верхней части и трещины по краю 80 мм треугольной магнитной мешалкой укладки перпендикулярно длинной оси яйца.
   Примечание: Для лучшего чувства, ни перчатки должны быть использованы, но руки должны быть вылечены с 70% этанола. Важно, что яичная скорлупа, а также яйцо мембраны открываются. Утечка яичный белок является безопасным признак того, что яйцо мембрана имеет перфорированные.
4. Яйцо держался ближе к нижней чашке Петри, чтобы избежать дальнейшей утечки яичный белок.
   Примечание: Во время первоначальной процедуры открытия, важно, что яичный белок на дне чашки Петри все еще ​​подключен к остальной внутри яйца, поскольку это приводит к вакуум внутри яйцо, которое проводит желток с зародышем внутри на вершине яйцо. Вакуума может регулироваться либо давление пальца, который контролирует поступление воздуха в яйцо или, подняв яйцо, которое увеличивает колонке связаны яичный белок, т.е. вакуум.
5. По мягко нажимая на меридиан проходит через трещины и экватора яйца по большим и средним пальцами можно регулировать вакуум. Содержание яйца могут быть переданы в чашке Петри неповрежденным, если яйцо с желтком плавно поднимается и обе половинки корпуса тщательно разделены. Эмбриона и желточного суда должны лежать на верхней части неповрежденной желток.
   Примечание: Если карандаш знак не хранится на вершине, эмбрион может быть больно, когда растрескивание оболочки. Если яйца не трескаются достаточно тщательно и эмбрионы старше 72 часов (см. выше), мешок желтка прилипает к оболочке и часто разрывов. То же самое происходит, когда влажность инкубатора ниже, чем 60% или яйца не поворачивается во время инкубации.
6. Экс ово культур возвращаются в инкубатор и выдерживают при 37,5 ° 38,2 ° С и влажности 60%. CO ₂ и O ₂ питания не требуется, если инкубатор не закрывается герметично (вентиляция сетки частично открыт!) И специальные чашки Петри с прокладками между крышкой и блюда используются.
   Примечание: Перемещение эмбрионов должно быть сведено к минимуму в течение первых дней инкубации. Слишком большое волнение приводит к высокой смертности. С 9-й день инкубации года, эмбрионы, менее чувствительны к агитации.
   Мертвые эмбрионы должны быть устранены немедленно, чтобы избежать инфекции.
   Если инкубаторов культуры клеток используются, которой герметически закрыты, O ₂ питания является обязательным для эмбрионов, чтобы не умереть. Влажность имеет важное значение для CAM, чтобы не иссякнуть, и если инкубации температура ниже 37 ° С, эмбрионы будут развиваться слишком медленно.

Часть 3: Применение веществ для ангиогенеза анализы

1. Автоклавного сложенном фильтровальная бумага (50,5 мм в диаметре) пробиваются через отверстие перфоратором и используются в качестве вспомогательных материалов (носитель) для жидкого вещества, применяемые для CAM.
   Примечание: Почти каждый перевозчик материала (см. таблицу ниже) вызвало раздражение CAM, особенно, когда применяется до инкубации 10-й день, так как она изменилась разработке архитектуры CAM судна. Это также включены потенциально инертные вещества, такие как гидроксиэтил фольги целлюлозы, тефлон губки (PTFE-pledgets), коллагеновые губки, коллаген фольги, стерильную марлю (мазки), круглая крышка скользит, и кремний колец, которые все вызванные ложным положительным результатам. Фильтровальная бумага, казалось, дело как минимум раздражение, и поэтому используется в наших тестах.
2. Когда CAM полностью разработана, до 6 разных образцах могут быть применены и их влияние можно сравнить на одной CAM.
3. Для того чтобы избежать высыхания фильтры дополнительные дозы (3 мкг родной angiotropin) или буфера (5 мкл PBS) должны быть вновь применен каждый день.
4. С 3-й день после нанесения, кровеносные сосуды ориентироваться на ангиогенных веществ на фильтрах, в то время как структура кровеносные сосуды, окружающие управления не изменится.
   Примечание: CAM не следует путать с желтком-мешок. CAM является динамично развивающейся структурой в то время как мешок желток с небольшим статических отклонений в процессе разработки. О развитии день три развивающиеся CAM могут быть признаны в первый раз на хвостовом конце зародыша как маленький пузырек. Между третий день и день десять первоначальный пузырек расширяется, создавая сложенном двухслойные мембраны зарастания мешок желтка все более быстрыми темпами. Веб-приложение должно быть на полпути между эмбрионом и складки CAM (границы), а в противном случае эмбриона препятствует микроскопические наблюдения эффектов в проходящем свете. Кроме того, фильтр с ангиогенных вещество внутренним, когда CAM продолжает расти.

Часть 4: Прививка клеток на CAM

4.1.Preparation клеток

1. Сливной клетки передаются от культуры колбу для FALCON труб с помощью стерильной 25 мл пластиковые пипетки с помощью пипетки помощи.
2. Для оценки количества клеток, 15 мкл суспензии клеток передается в камеру Нойбауэр и клеток подсчитываются вручную под микроскопом.
3. Сокол труб центрифугируют в течение 3 мин при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре и супернатант отбрасывается.
4. Для живых отслеживания клетки, клетки разводили PBS до нужной концентрации (здесь: 2х10 ^{7 клеток} / мл) и окрашивали например PKH26 (Sigma), красный флуоресцентный живых клеточных мембран маркировке комплекта, в зависимости от производителя протокол.
   Клетки ресуспендировали в культуре клеток среды (преимущественно средний Дульбеко изменение орла; DMEM) до нужной концентрации для инъекций (10 ⁷ клеток / мл) или прививка (3х10 ⁶ клеток / мл). Различные концентрации клетка применяются для инъекций против прививки в соответствии с концентрацией, уже опубликованных в литературе ^15-17 и нашего опыта.

Прививка 4,2 клеток на CAM

1. Кольца (~ 1 мм толщиной) вырезаны из 1мл кончиком пипетки или периферического венозного катетера (ПВЛ) трубки с помощью острого скальпеля и применяется к веб-камера E6-E14 куриного эмбриона культурный ово отл.
   Примечание: Старайтесь не "видел" несколько раз, но, чтобы прорваться через кончика пипетки или катетер, трубка с одной обработке с использованием новых, очень острым скальпелем, чтобы избежать острых кромок на результате колец. Проверьте круги под микроскоп для острых углов в результате микро-трещины.
2. В зависимости от размера кольца 20 мкл 3x10 ⁶ клеток / мл клетки пипеткой в общей сложности в одно кольцо или как разделить объемы в несколько колец.
   Примечание: В некоторых случаях травматизации CAM, осторожно выскабливание является предварительным условием, например, для облегчения инокуляции клетки ¹⁷ и capillarisation трансплантатов (см. ниже). Если, однако, травматизации CAM не предназначена или противопоказано, например, для исследования инвазивный потенциал опухолевых клеток, кольца не должна использоваться для прививок, но клетки должны применяться непосредственно, как применение кольца или кольца, сами по себе могут вызывать поражения микро- . Если кольца используются, их следует сократить как можно тоньше, чтобы минимизировать вес и избежать отступ CAM.

Часть 5: Intravitreous инъекции клеток

1. Шприце Hamilton микролитр промывают несколько раз с 70% этанола и, наконец, стерильной PBS.
2. Микро шприц наполнен подготовлены окрашенные или неокрашенные клеточной суспензии (см. часть 4.1).
   Примечание: инъекции должна быть тщательно подобраны, чтобы не повредить кровеносные сосуды CAM или смежных структур эмбриона (brain!) более чем на проникновение иглы. Инъекция должна быть сделана под рассечение бинокль.
3. Под микроскопом контроль, Осторожно, но быстро проникают CAM и глаз слоями с иглы шприца и постоянно вводят 10 до максимальной 20 мкл суспензии клеток (преимущественно разводят в PBS) в стекловидное тело из куриного эмбриона культурный ово отл.
   Примечание: Если CAM не может быть пронизана иглы, он может быть удален в сайт с мало или совсем нет кровеносных сосудов, аккуратно разрывая его на части с двумя щипцами.
4. Игла должна оставаться 1-2 секунд в глаза, чтобы избежать потери вводили суспензию клеток в результате утечки.

Часть 6: Препарирование почки куриного конечностей

1. Яйца будут удалены из инкубатора после 3-х до 4 дней инкубации (E3/E4 = Гамбургер Гамильтон (HH) stage18-23)
2. Яйца имеют трещины на краю треугольной магнитной мешалкой и переносили в чашки Петри (подробности: см. часть 2) и эмбрион расчлененный с подключенного суда желток, сокращая круг, используя весной ножницами.
3. Эмбрион переносится на свежем чашке Петри заполненный холодным, стерильным PBS за счет использования небольшого ложка процедить и омывается рода агитации.
4. Эмбрион переносится в небольшой чашке Петри заполнена стерильной PBS и освобождается от окружающих оболочек, осторожно отрывая их друг от друга с мелкими щипцами.
5. Лимб почки отделяются от микрохирургической щипцов как можно ближе к телу, как возможно, поняли и переданы в веб-камера 8-10-дневных куриных хост культурный ово бывший (см. прививки процедуры).

Часть 7: Подготовка почки мыши конечностей

1. Время беременных вязки создаются и утром того дня, когда вагинальные плагин обнаруживается в брачных женщин обозначен беременности 0 день.
2. Беременные женщины приносят в жертву цервикальным сдвигом, когда развитие эмбрионов достигли эмбриональных день (Е) от 10 до 13 и фиксируется на восковой доске.
3. Брюшной стенки смоченной 70% этанола, разрезать вдоль средней линии и кожных лоскутов крепятся сбоку от булавки.
4. Оба рога матки удаляют из брюшной полости, отдельных и переносят в стакан с холодной PBS.
5. Эмбрионов разделены, переданы в чашку Петри и матки стены и зародышевых оболочек удаляются тщательно с помощью щипцов.
6. Лимб почки срезают при помощи ножниц или весной отдельные тонкими щипцами как можно ближе к телу, как возможно, поняли и переданы в веб-камера 8-10-дневных куриных принимающей культурные ово бывший (см. прививки процедуры).

Часть 8: Сбор образцов опухоли

1. Опухоль биопсии собраны в 2 мл пробирок Эппендорф заполнены опухолевых клеток конкретных культуральной среде (здесь: средняя Leibovitz) и выдерживают при комнатной температуре.
2. Опухоль биопсии разрезают на 1-2 мм3 произведения стерильных скальпелей.
   Примечание: Если опухоль образцы были слишком малы, они не могли бы приложить к CAM, если бы они были слишком большими, CAM может быть ранен и эмбрион может умереть.
3. Часть от основного образца биопсии привиты CAM из 8-10-дневных куриных хост культурный ово бывший (см. прививки процедуры).
   Примечание: Принимая материала с поверхности биопсии увеличивает риск заражения мышцы или соединительной ткани.

Часть 9: Прививка процедуры

1. Для пересадки конечностей почки или опухоли образцов, полностью разработан веб-камера 8-10-дневных куриных эмбрионов культурный бывший ово используется.
2. Трансплантатов находятся в идеальном положении на CAM возле бифуркации У кровеносных сосудов.
3. В нужном месте применения, CAM избирательно травмированы нежный от соскабливания (щипцы) peridermal верхней части двойного эпителиального слоя, оставляя нетронутыми базального слоя.
   Примечание: Важно, чтобы избежать кровотечения или видимого разрыва капилляров.
4. Трансплантата передается CAM с минимальными PBS прилагается. В зависимости от взяточничества, как он может размещаться один или два раза на сайте CAM, где нет окончательного прививки предназначены для удаления чрезмерного PBS и, наконец, привитый на подготовленный травмированы CAM сайта.
5. Трансплантат захвачен штраф пинцет и слоистые на CAM. В зависимости от чувствительности трансплантата, светового давления могут быть применены (не подходит для конечности почки) для маневра трансплантата в результате отступ CAM (подходит для образцов опухоли).
   Примечание: Как цыпленок иммунная система развивается при эмбриональном день (E) 18, экс ово культур ксенотрансплантаты не должно быть продлен за пределы E17 в качестве хост куриных эмбрионов часто умирают.
   Важно иметь в наличии CAM, хозяин, соответственно куриных эмбрионов культурный ово отл, приуроченный к источнику донорской ткани по Вашему выбору.

Часть 10: Re-прививки

1. Эмбриона хозяин цыпленка убили обезглавливание.
2. CAM сприлагается трансплантата снимается круговым вырезом с острыми ножницами и переносят в чашки Петри, заполненные PBS.
3. Чрезмерное CAM вырезан из трансплантата к весне ножницы, за исключением бывших сайт привязанности.
4. В случае больших образцов опухоли, привитой разрезают на половинки или несколько более мелкие куски и повторно привиты с передний край перед новым CAM второго хозяина.

Часть 11: Представитель Результаты

Рисунок 1. Shell-менее куриные культуры
Куриные эмбрионы различных этапах развития культурного бывший ово в чашках Петри.

Рисунок 2. Ex ово ангиогенеза CAM анализа
Оплодотворенные яйца куриные инкубировали горизонтально со скоростью 37 ° С и влажности 60 - 62%, а трещины в чашки Петри на эмбриональной день 4 (Е4). Инкубационный был продолжен на тех же условиях. На E10 стерильной фильтровальной бумаги (5,5 мм в диаметре) были слой поверх CAM и пропитанные или с 5 мкл PBS или 3 мкг родной angiotropin6. Капилляры были видны в направлении выравнивания angiotropin пропитанной фильтровальной бумаги на E14.

Рисунок 3. Ex ово пересадки почки конечностей
Лимб почек от цыпленка (E3/E4) и мыши (E13) были привиты CAM оболочки менее культур курицы. Кровеносные сосуды из CAM вошел конечности почки через два дня. Развитие конечностей почки продолжена в этих бывших ово культур идущие две фаланги этап в куриных и отображения снижение межпальцевых ткани в мышиной почки конечности.

Рисунок 4. Ex ово инокуляции опухоли образца
Биоптата рака мочевого пузыря был на прививку CAM из 10-дневного куриного эмбриона культурный ово отл. Через два дня в области культуры, опухоли образца была связана с сосудистой CAM и через 7 дней, многочисленные кровеносные сосуды ввода трансплантата не наблюдалось.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Инновационные или просто еще один протокол куриных культуры?

С бывшего корпуса менее протоколы культуры ^1-4 общие показатели выживаемости куриных эмбрионов были низкими, например, ок. 30% ^1. Изысканный бывший ово протокол культуры, описанные в этой статье ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Eggs	Animal	Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice	Animal	Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray	Tools	Siemens AG	9503	Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160	Tools	Grumbach, Germany	8101	Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS	Reagent	Sigma-Aldrich		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium	Reagent	Sigma-Aldrich	D 6429	DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium	Reagent	Invitrogen	31415-029	here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium	Reagent	Sigma-Aldrich		each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH	Reagent	Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm	Tool	VWR international	442-0391	A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight	Tool	Fine Science Tools	14094-11	Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl	Tool	Hamilton Co	80222	Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm)	Tool	Fine Science Tools	18073-15	Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels	Tool			Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon	Tool	Geuder	15758	Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins	Tool	Home made		Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm	Tool	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes 92 x 16 mm	Tool	Sarstedt Ltd	82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm	Tool	Greiner Bio-One	664160	extra deep, with spacers for ventilation
Beaker	Tool			300-600 ml
FALCON tubes	Tool	Falcon BD		15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips	Tool			Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL)	Tool	Viggo®		Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips	Tool	Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter	Tool	Schleicher Schuell	311643	Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm	Tool	santec-medical	REF 277, LOT 832/511-1	Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000	Reagent			Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF	Reagent	BASF	S30200	mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura	Tool	Baxter Internationl Inc.	REF B2246000999999	Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm	Tool	Assistent Germany	1001/0011	Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge	Tool	Wyeth Animal Health		Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane	Tool	Resorba Woundcare Germany	LOT 280303	Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs	Tool	Fink Walter GmbH	REF 328132	Carrier; caused false positive results