Измерение коэффициентов диффузии через двухфотонной флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания

Резюме

В этой статье мы опишем методику измерения коэффициентов диффузии использованием многофотонной флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания. Мы начнем, совместив лазерной вдоль оптического пути к образцу и определения надлежащих параметров эксперимента, а затем продолжить создание и, наконец, установка флуоресценции кривые восстановления.

Аннотация

Multi-флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания является микроскопия техника, используемая для измерения коэффициента диффузии (или аналогичные параметры транспорта) макромолекул, и может быть применен к обоим

протокол

1. Выровнять по оптике.

Основное оборудование для MP-FRAP эксперимент включают в себя: синхронизацией мод лазерного источника, ячейки Поккельса (для модуляции пучка), импульсный генератор, дихроичных, объектив, флуоресценция выбросов фильтр, закрытый ФЭУ, а также систему записи данных (счетчик фотонов и многоканальных масштабирования).

2. Определите безопасные полномочия монитора.

1. Ослаблять лазера низкой, но разумной, мощность генерации флуоресценции в образце.
2. Фокус в образце.
3. Установить счетчик фотонов интегрировать по шкале времени гораздо дольше, чем ожидалось, восстановление флуоресценции. С фокальном объеме проведены стационарные внутри образца (на наш микроскоп программного обеспечения это достигается точка сканирование), запись разумное число фотонов данные счета.
4. Увеличение мощности и сделать еще один ряд данных фотона в счет. Повторяйте, пока увеличение фотоотсчетов представляется значительно сократиться по отношению к власти возрастают.
5. Участок журнал (фотоотсчетов) в зависимости от журнала (мощности). Отклонение от склона двух указывает отбеливания в течение монитора. Выберем в качестве монитора власти силы, которая ниже этого отрезаны, но которая позволяет в течение разумного отношения сигнал-шум.

3. Определение входных параметров генератора импульсов и многоканальные масштабирования.

1. Определите, назад--конвертов оценки коэффициента диффузии и время восстановления на основе литературы и / или Стокса-Эйнштейна уравнение и уравнение диффузии.
2. Установить необходимые значения параметров генератора импульсов и масштабирования.
   1. На генератор импульсов, набор заранее отбеливателя и отбеливатель раз. Хороший набор эмпирических правил является то, что предварительно отбеливатель должен составлять 1-2 раз больше, чем ожидаемое время восстановления половине, и отбеливатель время должно быть одной десятой ожидаемое время восстановления половины.
   2. На масштабирования, установите бен шириной примерно половина отбеливателя продолжительность, и установить число контейнеров в соответствии с записью, что продукт вашего выбранной толщины бункера и бункеров на запись больше или примерно равна вашей ожидать полного восстановления плюс предварительно -отбеливатель и отбеливатель раз.
   3. Вернуться на импульсный генератор и установить частоту pre-bleach/bleach/monitor последовательности равна значению просто меньше, чем обратная продукт бен ширина раза число контейнеров на запись. *
   4. Наконец, установите количество записей / сканирование на масштабирования основана на интенсивности сигнала на выбранном питания монитора.
      
      * Очень важно, что время для полной последовательности pre-bleach/bleach/monitor (1/frequency), выставленный на генератор импульсов больше времени сбора данных (бен ширина х бункеров / запись), выставленный на масштабирования. Если этот критерий не выполняется, несколько триггеров отбеливатель может появиться в одной записи на масштабирования.
3. Установить питания монитора до приемлемого уровня, определяемого ранее. Установить отбеливателя мощности до 200 мВт или около того выше отбеливания отсечки определяется во время отбеливания монитор тест. Эти полномочия и установить в качестве различных напряжениях на ПК кристалла.
4. Печать микроскоп, выключите свет, включите PMT, начинают точки сканирования на микроскопе программного обеспечения, а затем начать генератор импульсов и масштабирования.
5. Анализ в результате восстановления кривую, кривую и маркировка три важных момента: 1) предварительно отбеливателя флуоресценции, 2) флуоресценции сразу после отбеливания, и 3) флуоресценции в конце набора данных. Использование флуоресценции значений до и сразу после отбеливания, чтобы лучше оценить половину времени на восстановление.
6. С этой оценкой полувосстановления временем, следует использовать эмпирические правила, изложенные ранее, чтобы определить новые значения для предварительного отбеливатели, дезинфицирующие средства, и длительности бен ширину. Кроме того, использование предварительно отбеливателя флуоресценции и флуоресценции в конце набора данных, чтобы лучше оценить время, необходимое для достижения полного выздоровления. Как правило, данные должны быть собраны за период времени, который позволяет для полного восстановления подлежащая представлению в отношении второй половины данных.
7. Настройка параметров генератора импульсов и масштабирования, принять новую кривую, и продолжить настройку параметров, пока ваша кривая экспонатов сильный отбеливатель и гладкой восстановления. Имейте в виду, что отбеливатель продолжительность может и должна быть меньше правило, если это возможно. Отбеливатель власти также могут быть скорректированы, если слишком мелко или слишком глубоко, отбеливатель достигнута.

4. Тест для возбуждения насыщения.

1. Использование соответствующий монитор и отбеливатель полномочий, определяется ранее, принять ряд MP-FRAP кривых. Анализ каждого восстановления, нормированная на заранее отбеливателя флуоресценции, используя соответствующую математическую форму и нелинейных наименьших квадратов алгоритма (см. "Анализ данных" ниже). Запись установлены значения отбеливателя параметр глубины.
2. Продолжайте прием и анализ последовательных серии MP-FRAP кривых при увеличении значения отбеливателя власти.
3. Участок журнал (параметр отбеливателя глубины) в зависимости от журнала (мощности). Любое отклонение от склона две указывает возбуждения насыщения. Выберите отбеливателя сила, которая дает сильный отбеливатель, но не вызывает насыщения.

5. Продолжать принимать MP-FRAP кривых.

1. Продолжать принимать кривые, как и выше, будет все параметры правильно установить.

6. Анализ данных.

1. Удалите предварительно отбеливателя и отбеливатель данные флуоресценции набор данных и настроить время данные, такие, что т = 0 соответствует значению флуоресценции сразу же после отбеливателя.
2. Нормализация в результате флуоресценции восстановления по отношению к средней заранее отбеливателя флуоресценции.
3. Установить нормированный кривой с использованием соответствующей математической модели и нелинейные, метод наименьших квадратов алгоритм подбора, такие как lsqcurvefit функции в MATLAB. Модель, представленная здесь приходится флуоресценции восстановление влияние как диффузии и конвективного потока:
   
   где F _о является заранее отбеливателя среднем флуоресценции, β является отбеливатель параметр глубины, τ _D является характерной диффузионной время восстановления, R представляет собой отношение квадрата осевой _(Ш) для радиальной (ш _г) ширина двухфотонного фокального объема, τ _VX = и _R / V _х, τ _иу = и _R / V _у, τ _уг = _Ш / в _г и V ² = V _х ² + V ² + _у V _Z ² является скорость конвективного потока. Для потока ограничивается изображениями плоскости, τ _VZ → ∞ и 1 / τ _VX + 1 / τ _иу можно заменить 1 / τ _VR. В отсутствие конвективных потоков, как экспонент в числителе к 1, и выражение значительно снижается, только два подгоночных параметров, β и τ _D. Коэффициент диффузии легко вычисляется как D = W _R ² / 8τ _D.

7. Представитель результаты.

Рисунок 1. Представителю отбеливателя и кривой восстановления для FITC-БСА. Хорошая кривая восстановления экспонатов сильный отбеливатель и гладкой восстановления, с флуоресценции на полное восстановление сообщается на вторую половину данных.

Рисунок 2. Нормализованной кривой восстановления для FITC-BSA (красный) и связанных наименьших квадратов (черный). Это соответствует доходности коэффициент диффузии 52,9 мкм2 / с, что согласуется с литературой.

Обсуждение

Сила многофотонной флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания заключается в его способности, чтобы исследовать толстых образцов с 3D-разрешение. С момента своего развития в 1990-х годов, MP-FRAP была использована для определения коэффициента диффузии (или аналогичные параметры...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ti:sapphire laser	Newport Corp.	Mai Tai
Pockels Cell	Conoptics	350-80
Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	Fluoview
Short pass dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	670 DCSX-2P
Photomultiplier tube	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Photon counter	Stanford Research Systems	SR 400
Multi-channel scaler/averager	Stanford Research Systems	SR 430
Pulse Generator	Stanford Research Systems	DG 535
FITC-BSA	Invitrogen	--