Моделирование мышей колит использованием декстрана сульфата натрия (DSS)

Резюме

Декстран сульфата натрия (DSS) вводят в питьевой воде является признанным мышиной модели воспалительных травмы острого колита. Этот протокол описывает метод для DSS лечения и подготовки ткани.

Аннотация

Колит может быть вызван вирусной или бактериальной инфекции, ишемический инсульт, или аутоиммунные расстройства, особенно неспецифический язвенный колит и толстой вариант Болезнь Крона - Колит Крона. Острого колита могут проявляться болями в животе и вздутие живота, нарушение всасывания, понос, Hematochezia и слизи в стуле. Мы начинаем понимать сложные взаимодействия между окружающей средой, генетики и эпителиального барьера в дисфункция Воспалительные заболевания кишечника и животных моделях колита, сыграли существенную роль в продвижении нашего понимания этого заболевания. Один из популярных моделей не предусматривает дополняющие питьевой воды мышей с низкой молекулярной массой декстран сульфата натрия (DSS), что приводит к повреждению эпителия и надежный воспалительную реакцию в толстой кишке в течение нескольких дней

протокол

Часть 1: Травма-Ремонт колит модели

1. Базовый вес должен быть получен для каждой мыши до начала лечения DSS.
2. Сделайте 3% (м / о) Декстран Сульфат натрия Солевой раствор в воде и фильтр с 0,45 мкм фильтр из ацетата целлюлозы.
3. Замените питьевую воду в клетке мыши с 3% DSS решение в течение четырех дней. Мышей не должны иметь доступ к любому другому источнику воды (т.е. советы исключения размещены на автоматизированные системы полива).
4. На четвертый день, замените DSS раствор водой в течение еще трех дней, что позволило некоторым толстой эпителиальных восстановления. Мышей должна быть взвешена на четвертый день для того, чтобы количественно системные последствия колита. Потеря веса общего с серьезной травмой.
5. На 7-й день, взвесить и жертвы мышей. Мыши могут быть умерщвлены путем ингаляционного передозировки изофлуран или другие институционально IACUC утвержденными методиками.

Часть 2: вскрытие и уборки Колон

1. Expose брюшной стороне мыши и безопасной ноги для обеспечения беспрепятственного доступа к животу. Влажные живота полностью с 70% этанола.
2. Возьмитесь средней линии живота с тканью щипцы и расширить вверх таким образом места для палаток кожи. Используйте с острым концом ножниц надрезать брюшко тем самым подвергая содержимого брюшной полости. Расширение Разрез до кончика xyphoid процесс в средней линии, а затем распространяется вдоль нижней аспект прибрежных полей на двусторонней основе.
3. Определить тонкой кишки, слепой кишки и толстой кишки. Осторожно рассекают / дразнить толстой кишки с окружающими брыжейки. Трансекта толстой кишки в глубине таза, чтобы освободить дистальной толстой и прямой кишки. Трансекта толстой кишки на colonocecal маржу, чтобы освободить проксимальных толстой кишки. Необходимо соблюдать осторожность во время этого процесса, чтобы не повредить толстую кишку, как очистка толстой кишки будет проблематично, если перфорация происходит.
4. Использование 20G игла кормления и 10 мл шприца, интубация и промойте толстой ледяной PBS до элюата совершенно ясно, кала.
5. На данный момент, если макроскопического анализа с рассекает микроскопом желательно, двоеточия может быть зафиксирован как "колбаса". Если гистологический анализ только желательна, чем приступить к Части 4 «Создание швейцарских Валки для гистологического анализа острого колита".

Часть 3: Обработка как "Колбасы" для макроскопических Анализ всей толстой кишки

1. Очень важно поддерживать правильную ориентацию толстой кишки, поэтому держать дистального конца толстой кишки ближе к оператору. Отрежьте два куска, не рассасывающиеся нити (SP116 1,5 метрический плетеные шелковые), один около 1 дюйма в длину, другие 2 дюйма.
2. Использование 2-дюймовый кусок шва, чтобы связать с дистального конца как можно ближе к краю, как возможно, сохраняя хорошее уплотнение.
3. Место 20G иглу кормления, содержащий 5 мл 10% буферный формалин фосфата в проксимальном конце толстой кишки. Свободно галстук оставшийся кусок шва сразу проксимальнее луковица кормления иглы. Возьмите толстую кишку твердо на луковицу кормления иглы и настаивать формалина до толстой кишки расширена. Затяните узел на шов, как вы снять кормления иглой, оставляя таким образом переплетаются, расширение толстой кишки, как "колбаса".
4. Заполнить 15 мл коническую трубку с 10% буферный формалин фосфата и место двоеточия в трубку. Fix течение 24 часов.
5. Вылейте формалина и заменить 70% этанола для дополнительных 24 часов. (Двоеточие могут быть сохранены в 70% этанола на неопределенное время при комнатной температуре.)
6. Удалить из толстой кишки конической трубе и сократить строки на каждом конце с помощью скальпеля, соблюдая осторожность, чтобы не повредить толстую кишку. Помните, что дистальный конец имеет самую длинную веревочку. Вырезать продольно от дистальной к проксимальной конце толстой кишки, так что он образует длинный лист. На данный момент, толстой кишки можно рассматривать под микроскопом вскрытии.

Часть 4: Создание швейцарских Валки для гистологического анализа острого колита

1. Очень важно поддерживать правильную ориентацию толстой кишки, поэтому держать дистального конца толстой кишки ближе к оператору.
2. Измерьте длину толстой кишки. Этот показатель является еще одним показателем тяжести травмы. Колит увеличивается отек и сокращает общую длину толстой кишки.
3. Использование с острым концом ножниц, надрезать продольно от дистальной к проксимальной конце толстой кишки. Использование тонкой наконечником захватить пинцетом или края разреза и открытой с боков продвигаясь дистально-> проксимально, демонстрируя тем самым толстой кишки в виде плоского листа.
4. Роллинг толстой кишки необходима пара щипцов и двуручным техники. Возьмите любого края дистального края щипцами. Приступить к последовательно рулон толстой кишки поворотом и выпуская щипцов перейти к проксимального края. Таким образом генерации спираль с третьим измерением, или "швейцарской ролл".Для поддержания формы проката, держитесь крепко ролл пинцетом и разрез ее 27G1 / 2 иглы. Безопасные иглы, согнув иглу при выходе из рулона.
5. Место обвалять в соответствующей маркировкой кассет ткани и поместите в банку с 10% буферный формалин фосфата при комнатной температуре в течение 24 часов, чтобы обеспечить фиксацию ткани.
6. Вылейте формалина и заменить 70% этанола для дополнительных 24 часов. (Двоеточие могут быть сохранены в 70% этанола на неопределенное время при комнатной температуре.)
7. Как только образец был зафиксирован, он может быть парафин, секционные и установлен на салазках для гистологического анализа.

Часть 5: Представитель Результаты

DSS модель для острого колита позволяет исследователю получать, фиксировать и анализировать толстой кишки, что модели острого колита. Когда рулет режется и монтируется, она должна стать представителем кусочек всей толстой кишки, если проката должным образом (рис. 1). Установлен рулон могут быть окрашены с H & E для того, чтобы определить степень повреждения толстой кишки, от дистальной (внутри) конец проксимальных (снаружи) концом (рис. 2). Immunohistochemistry также может быть выполнена на рулет для идентификации и количественного определения воспалительных инфильтратов. Если колбаса метода была выполнена правильно, фиксированный толстой кишки будут расширены и всей поверхности слизистой оболочки можно легко манипулировать и рассматривать под микроскопом рассечение (рис. 3).

Рисунок 1. Должным образом выполнены "рулет". (А) толстой кишки выпадает из дистальнее проксимального конца, пересекаются с иглой и обеспеченные изгиба конца иглы. Он помещается в ткань кассеты для фиксации. (B) H & E 5 мкм окрашивали разделе рулет из толстой кишки мышей получавших DSS (D = дистальной толстой кишки р = проксимальных толстой кишки).

Рисунок 2. DSS рассматриваются двоеточия проявлять признаки острого колита. Воспаление и склеп повреждения проявляются в DSS обработанных толстой кишки по сравнению с воды, обработанной контроля.

Рисунок 3. Пример "колбаса". Колбасы придают с формалином и полностью расширен. Небольшим углом будет присутствовать вторичной по отношению к естественной кривизны толстой кишки. Открыл колбасы должны сохранять плоскую форму.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол может быть изменена для модели острого повреждения, травмы, ремонт, или хронические процессы толстой травмы.

Модификация острого травматизма:

DSS лечения импровизировать в течение 4-6 дней, после чего немедленно жертвы

Травма-Рем?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran Sulfate Sodium Salt	USB Corp., Affymetrix	9011-18-1	mol wt 40,000-50,000
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Scientific	SF100-4
Isoflurane, USP	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	NDC 57319-474-06
TISSUE PATH Macrosette Cassettes	Fisher Scientific	15182706
BD 10 ml Syringe	BD Biosciences	309604
Ethyl Alcohol	Pharmco-AAPER	E190	Dilute to 70% with distilled water
20G Straight Feeding Needle	VWR international	20068-612
27G1/2 PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305109
Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip	VWR international	82027-588
Waugh Forceps	VWR international	82027-428
Non-absorbable Suture	LOOK Surgical	SP116
Whatman Blotting Paper	VWR international	28298-020	Cut as needed
Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter	Cole-Parmer	EW-06731-2
Carbon fiber composites digital caliper	Fisher Scientific	15-007-958