Спинной мозг электрофизиологии

Резюме

Демонстрация изоляции новорожденных мышей спинного мозга для электрофизиологических исследований.

Аннотация

Новорожденных мышей спинного мозга представляет собой модель для изучения развития нейронных схемотехника и опорно-двигательного движения. Мы показываем, спинного мозга и рассечение подготовке записи ванны искусственного спинномозговой жидкости используются для опорно-двигательного исследований. После рассеченные, спинного мозга вентральной нервных корешков может быть присоединен к записи электродов для записи электрофизиологических сигналов центральной схемы создания картины в поясничном мозга.

протокол

1. Подготовка искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF) 1. Мы сначала подготовить 2 л 10X запас aCSF без магния и кальция. Реагенты, перечисленные в миллимолярных. Каталог цифры относятся к Sigma / Aldrich.

2 литра 10X aCSF (без Mg или Ca)
Реагент	мМ	g/2L	Каталог
KCl	40	5,96	P-9333
NaCl	1280	149,61	S-7653
NaHCO 3	210	35,28	S-6297
NaH 2 PO 4	5	1,38	S-9638
Глюкоза	300	108,12	D-9434
Добавить дистиллированной водой до 2 л

Мы также будем готовить 1М растворов MgSO ₄ и CaCl ₂ в 50 мл воды, чтобы обеспечить корректировку молярность от эксперимента к эксперименту и обеспечить кальция остается в растворе.

1M кальция и магния Акции
Реагент	М	g/50mL	Каталог
CaCl 2	1	7,35	C-5080
MgSO 4	1	12,33	M-5921

Решение aCSF должны быть отравлены газом с карбогена (95% О2 / 5% СО2), чтобы снизить рН перед добавлением кальция или кальция будет выпадать в осадок.

1 литр aCSF
Реагент	Объем
10X aCSF	100 мл
1М CaCl 2	1 мл (рассечение) 2 мл (запись)
1M MgSO 4	1 мл
Добавить ~ 800 мл дистиллированной воды, газа с карбогена в течение 2 минут перед добавлением кальция
Добавить дистиллированной водой до 1 л.

Насосы и насосно-компрессорные и рассекает блюда должны быть промыты до и после использования.

Рассечение

Хотя рассекает, 1мМ кальция aCSF следует постоянно газом с карбогена. ACSF можно перекачать из бутылки рассекает блюдо и перекачивается из рассекает блюдо к бутылке или отправлены в отходы. Мы используем эластомер (Sylgard, Dow Corning), покрытых блюдо выполнить рассечение.

Новорожденных мышей быстро обезглавленный с острыми ножницами и разрез, сделанный с помощью ножниц по вентральной грудной клетки и живота. Животное тогда потрошился. Потрошился мыши промывается aCSF. Животное тогда возлагали на вскрытии блюдо с насекомыми контактов вводится через передние конечности и у основания хвоста.

Позвоночника снимается, выполняя вентральной ламинэктомия. Позвоночника проводится с небольшими щипцами и один лезвие маленькие ножницы вставляется спины сразу костлявые позвоночника. Пластинки разрезается на одной стороне, а затем другие, мягко подъема костлявые позвоночника. Это осуществляется по длине позвоночника.

Спинного мозга удаляется путем разрезания вдоль обеих сторон спинного мозга разорвать корешки спинномозговых нервов и сократить мозговых оболочек окружающих спинной мозг. Режем на левой и правой сторон, то мы сократим мозговые оболочки прикреплен к спинной стороне спинного мозга, чтобы освободить его. Изолированных шнур затем возлагали на блюдо рядом с входом aCSF для обеспечения хорошей оксигенации, если дополнительные животные расчленены.

Изолированных спинного мозга, затем переведен в записи блюдо с помощью небольшого ложкой или лопаточкой. Здесь мы заливать препарат с кислородом кальция 2 мМ aCSF. Спинной мозг прижат к эластомера покрытием блюдо и микроманипуляторами используются для перемещения внеклеточной, целые электродов всасывания корневого возле корней. Когда электрод находится вблизи свободного конца корня, нежное всасывание применяется привлечь внедряются в всасывающего электрода. Этот процесс может быть повторен для записи несколько корней одновременно.

Рисунок 1. Обезглавливание и Evisceration. A. Быстро обезглавить мышь с острыми ножницами. Больше или меньше взносов ствола мозга может быть достигнуто в зависимости от уровня среза. B. Место один лезвие ножниц в отверстие грудной полости созданные обезглавливание. Открытое вентральной грудной клетки и брюшной полости до основания хвоста. Удалите внутренности и промыть aCSF.

Рисунок 2. Удаление позвоночника. A. Вставьте левый лезвие ножниц в пространство между позвоночника и спинного мозга справа от спинного мозга и прорезают кости прокладки брюшной части мозга. Затем вставьте право лезвие ножниц в пространство между позвоночника и спинного мозга, слева от спинного мозга и разреза. Б. Повторите эту процедуру при применении нежной тяги к позвоночнику. Будьте осторожны, не прокол спинного мозга, держа ножницы под небольшим углом.

Рисунок 3. Удаление спинного мозга. A. Вставьте левый лезвие ножниц в пространство между спинным мозгом и кости справа от спинного мозга и прорезать корешков спинного мозга и мозговых оболочек прокладки сбоку от мозга. Затем вставьте право лезвие ножниц в пространство между спинным мозгом и кости слева от спинного мозга и прорезать корешков спинного мозга и мозговых оболочек прокладки сбоку от мозга. B. Наконец, осторожно поднимите ростральной мозга и мозговых оболочек вырезать подключения спинной мозг к пластинок. Снова старайтесь не прокол спинного мозга, держа ножницы под небольшим углом. Ничего не вырезано корни слишком близко к спинному мозгу.

Обсуждение

Изолированных новорожденных спинного мозга обеспечивает послушный метод изучения нервной системы развитию1, 2. В поясничного спинного мозга у новорожденных грызунов, центральный схемы генерации картина может производить фиктивные передвижения в присутствии медиаторов. Это фиктивны...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl		P-9333
NaCl		S-7653
NaHCO3		S-6297
NaH2PO4		S-9638
Glucose		D-9434
CaCl2		C-5080
MgSO4		M-5921
Large Scissors	Fine Science Tools	14070-12
Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Sylgard 184 (Dow-Corning)
1L volumetric flask
100mL volumetric flask