JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта технология позволяет использовать с высоким разрешением магическим углом спиннинг протона МР-спектроскопия (HRMAS 1H-MRS) для молекулярных характеристик живых Дрозофилы С обычными 14,1 тесла спектрометр оснащен датчиком HRMAS.

Аннотация

Высокого разрешения магическим углом Спиннинг (HRMAS) протонной магнитно-резонансной спектроскопии (

протокол

Часть 1: Подготовка дрозофилы для измерения HRMAS

  1. С помощью стандартных процедур flylab 1, собирают вновь eclosing мух в течение 3 дней и передачи им летать флаконах, содержащих свежие продукты летать. Инкубируйте собранных мух в течение 5 дней, чтобы мухи станут 5-8 дней непосредственно перед экспериментом. Только одного пола (обычно мужчины) используется для экспериментов.
  2. Используйте здоровые, неповрежденные дикого типа мухи сравнить с обработанными например, травмированные или генетически измененных мух 1.
  3. Место одного летит в 2 мл пробирки, содержащие часть (~ 0,2 мл) летучей пищи за 24 часов до эксперимента. Эти трубки медведя отверстие в трубке чашку с использованием пламени нагревают инсулина иглу.
  4. Взвесьте трубы непосредственно до и после вставки летать использованием высоких баланс точности и определить вес каждого летать с вычитанием первое значение из последнего. Одного мужчины летают весит обычно 0,7-1 мг.

Часть 2: Подготовка HRMAS ротора.

  1. Место одной трубки на льду в течение менее чем за минуту, чтобы обезболить летать внутри.
  2. Положите летать на слой алюминиевой фольги помещают на лед и нажмите летать мягко в полусферической полые пространства вставить ЯМР ротора с помощью мягкой щетки, чтобы обеспечить полное включение летать, избегая при этом летать травмы.
  3. Место вставить оксида циркония (ZrO 2) трубы ротора (4 мм в диаметре, 50 мкл), чтобы найти мухи между ротором вставки и нижней части ротора (см. рисунок 1).
  4. Закрыть вставка с винтом и покрыть ее парафильмом (см. рисунок 1), чтобы предотвратить контакт между летать и решение TSP стандарт (TSP: триметилсилил-пропионовая-2 ,2,3,3-d4 кислоты, Mw = 172, δ = 0,00 промилле, 50 мм в дейтерированных водой D 2 O, которые функционируют в качестве ссылки для сдвига резонанса химического и количественного).
  5. Добавить 8 мкл TSP стандартное решение на верхней части ротора вставки. (См. рисунок 1).
  6. Безопасные и затянуть весь созданный в роторы с верхней крышке (см. рисунок 1).

Часть 3: HRMAS сбора данных

  1. Ввести ротора в зонд HRMAS и расположите его под магическим углом 54,7 ° (см. рисунок 1).
  2. Установите температуру на 4 ° С BTO-2000 блок в сочетании с единицы пневматического МАС. Мухи хранить при температуре 4 ° С в то время как в спектрометр для поддержания анестезии.
  3. Установить HRMAS 1 H МРС спиннинг ставка в 2 MAS кГц.
  4. Стабилизация частоты вращения MAS на 2,0 ± 0,001 кГц контроллер MAS скорость (частота вращения).
  5. Для магнит приготовления: настройка и соответствуют катушки для оптимальной производительности и прокладку магнитом для оптимального качества спектров.
  6. Приобретать одномерных 1 H спектров с использованием ротора синхронизированы Карр-Перселл-Мейбума-Гилл (CPMG) спиновое эхо последовательности импульсов 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) п приобретения], который работает как T 2 фильтра удалить уширения спектра ЯМР 1 Н одном лету спектров приобретенных одномерных данных по всем образцам. Синхронизация между задержки импульса (τ = 500μs) с частотой вращения MAS (2 кГц). Установить число переходных процессов при 256 с 32 768 (32k) точек данных. Приобретение время 9 мин.
  7. Приобретать двумерных (2D) 1 H-1 H ЯМР HRMAS одного лету спектры на всех образцах использованием TOBSY последовательность импульсов с адиабатическим 3. Приобретение параметрами являются: 2k точек данных прямого измерения (11 частей на миллион ширина спектра), 1 с водой предварительно насыщения в процессе релаксации задержки, 8 сканирований в прирост, 128 шагом, общее время повторения 2 сек, 45 мс, время перемешивания, и в общей сложности приобретением время 29 мин.

Часть 4: Обработка данных / Анализ

  1. Анализ образцов MRspectra использованием MestReC программное обеспечение (Mestrelab исследований, www.mestrec.com)
  2. Используйте уширения аподизации функцией 0,5 Гц и применяются ко всем HRMAS 1 H FIDS до преобразования Фурье.
  3. Ссылка спектров MR по отношению к TSP в δ = 0,0 промилле (внешний стандарт).
  4. Фазы спектров вручную и применять базовые оценки Уиттекер вычесть основных компонента базового до пика расчетами области.
  5. Оценка площадей пиков использованием MestReC программного обеспечения. Шкала высот пиков по отношению к TSP для каждого приобретенного спектра (TSP высота пика = 1). Использование Т-тестов (с двумя хвостами, р <0,05), для сравнения в группе, чтобы между-групп коэффициентов.
  6. 2D параметры TOBSY процесса являются: QSINE = 2 функция окна в обоих измерениях, FT с 2k точек в прямом измерении и нулевой наполнения 1k во втором измерении, фазовую коррекцию в обоих направлениях и коррекция базовой линии во втором измерении.
  7. Продукция 2D-спектров с использованием программы Спарки (TD Годдарда и Д. Г. Неллер, SPARKY 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/Главная / Sparky /)

Часть 5: Представитель спектры от игрового мухи дрозофилы

Процедур, описанных выше разрешение собирать воспроизводимых спектров от живых мух Drosophila MELANOGASTER. На рисунках 2 и 3 показаны спектры представитель MR, приобретенных в дикого типа (WT) Орегон-R мух. На рисунке 2 представлены 1D 1 H HRMAS CPMG спектров. Основные компоненты липидного [C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1.58ppm), С H 2 C = C (2,02 промилле), С H 2 C = O (2,24 промилле), C H = C H (5,33 промилле)], глицерина (1,3-C H 4,10 промилле и 4,30 промилле; 2-CH 2 5,24 промилле), и малых метаболитов: β-аланина (β-Ala , 2,57 промилле), ацетат (Ас, 1,97 промилле), фосфохолин (PC, 3,22 промилле) и phophoetanolamine (ПЭ, 3.23ppm) были обнаружены и присваивается в соответствии с предыдущих докладах 4, 5. Сигналы на 2,02 промилле были назначены на метиленовых протонов C H2-CH = CH фрагмент моно-ненасыщенных жирных кислот (т.е. пальмитолеиновой). Ненасыщенных кислот были определены сигнала на 5,33 промилле производства протонов-CH = CH-группу. Малый метаболиты, которые не могут быть назначены или не были видны использованием 1D спектра были обнаружены с помощью 2D-1 Н-1 Н TOBSY HRMAS (см. рисунок 3).

figure-protocol-6833
Рисунок 1. Экспериментальная настройка в естественных условиях HRMAS 1H MRS для исследования живых дрозофил на 14,1 Т. Внешний стандарт триметилсилил-пропионовая-2 ,2,3,3-d4 кислоты в дейтерированных воды (TSP / D 2 O). На площади: положение ротора под магическим углом в HRMAS зонда.

figure-protocol-7283
Рисунок 2. В естественных условиях 1D HRMAS 1 H CPMG спектры жить дрозофилы летать MELANOGASTER вес. Липидных компонентов: C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1.58ppm), ацетат (Ас), С H 2 C = C (2,02 промилле), C H 2 C = O (2,24 промилле), β-аланина (β-Ala), фосфохолин (ПК) и phophoetanolamine (PE), глицерин (1,3-C H 4,10, 4,30 промилле; 2-C 2 H 5,22 промилле) , C H = C H (5,33 промилле).

figure-protocol-8075
Рисунок 3. В естественных условиях 2D 1H-1H TOBSY HRMAS спектр жить дрозофилы вес летать на 14,1 Т. Малый метаболитов и липидных компонентов были определены. Метаболиты: аланин (Ala), β-аланина (β-Ala), аргинина (Arg), глютамин (Gln), глутамата (Glu), ПК фосфохолин (ПК), phophoetanolamine (PE), таурин (Тау), α-глюкозы (α-GLC) и глицерин. Липиды компонентов: C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1,58 промилле), С H 2 C = C (2,02 промилле), С H 2 C = O (2,24 промилле), C H = C H (5,33 промилле).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

За исключением последнего доклада возможности в естественных условиях МРТ у плодовых мушек 6, в естественных условиях MRS исследования у дрозофилы до сих пор не сообщалось. В настоящее время протокол, мы описываем реализацию романа в естественных условиях HRMAS

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Massachusetts General Hospital Институциональный комитет Исследования животных Review Board.

Благодарности

Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья (NIH) предоставлять AI063433 к Лоуренс Г. Rahme, Национального института Институтов Здоровья (NIH) Центр Грант (P50GM021700) Рональда Г. Томпкинс (А. Ария Tzika, директор основные ЯМР), и больница Шрайнер по делам детей исследовательского гранта (# 8893) А. Ария Tzika. Мы благодарим Dionyssios Mintzopoulos кандидат за помощь в начальные фазы развития этого протокола и Овидиу С. Andronesi кандидат за помощь в TOBSY импульсной последовательности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Deuterium oxideReagentSigma-Aldrich7789-20-0
3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acidReagentSigma-Aldrich24493-21-8
agar, sucrose, yeast, cornmealFoodGenesee Scientifichttp://www.flystuff.com/
Oregon RS or Canton-S fliesAdult fly linesBloomington Stock centerhttp://flystocks.bio.indiana.edu/
PaintbrushEquipment(size 0)
2ml tubesEquipmentFisher ScientificK749521-1590
Fly incubatorsEquipmenthigh humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle.
Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe EquipmentBruker Corporation
BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unitEquipmentBruker Corporation
4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul)EquipmentBruker CorporationB3829 (Bruker store)
MestReC (Mestrelab Research) Software1D NMR spectra analysis
http://mestrelab.com/
SPARKY 3, USCFSoftware2D NMR spectraanalysis
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

Ссылки

  1. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
  2. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
  3. Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
  4. Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
  5. Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
  6. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
  7. Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience38HRMASTotal TOBSY

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены