Привет-C: метод изучения трехмерной архитектуры геномов.

Резюме

Привет-C метод позволяет непредвзято, генома идентификации хроматина взаимодействия (1). Привет-C пар перевязки близости и массивно параллельной последовательности. Полученные данные могут быть использованы для изучения геномной архитектуры в различных масштабах: первые результаты определены такие функции, как хромосомы территорий, разделение открытых и закрытых хроматина, а также структуры хроматина в масштабах megabase.

Аннотация

Трехмерной раскладной хромосом compartmentalizes генома и может принести и далеких функциональные элементы, такие как промоторы и энхансеры, в тесный пространственной близости ^2-6. Расшифровка отношения между организацией хромосомы и геном деятельность будет способствовать пониманию генома процессы, как транскрипции и репликации. Тем не менее, мало известно о том, как хромосомы раза. Микроскопия не в состоянии различить большое количество локусов одновременно или с высоким разрешением. На сегодняшний день обнаружения хромосомных взаимодействий с использованием хромосомы конформации захвата (3C) и его последующей адаптации требуется выбор набора целевых локусов, что делает генома исследования невозможно ^7-10.

Мы разработали Привет-C, расширение 3C, что позволяет идентифицировать долго взаимодействия диапазон в объективной, генома моды. В Привет-C, клетки фиксируют с формальдегидом, в результате чего взаимодействующих локусов быть связанными друг с другом посредством ковалентных ДНК-белковых сшивок. Когда ДНК впоследствии фрагментирован рестрикции, эти локусы остаются связанными. Биотинилированного остаток включен в качестве 5 'свесы заполнены дюйма Затем, тупой конец перевязки проводят под разбавленный условия, которые способствуют перевязки события между сшитых фрагментов ДНК. Это приводит к генома библиотека лигирование продуктов, соответствующих пар фрагментов, которые изначально были в непосредственной близости друг от друга в ядре. Каждый продукт лигирования отмечен биотина в месте соединения. Библиотека стриженой, а переходы потянул вниз стрептавидином шарики. Очищенная переходами может впоследствии быть проанализированы с помощью высокой пропускной секвенсор, в результате чего каталог взаимодействующих фрагментов.

Прямой анализ в результате контакта матрицы выявляет многочисленные особенности геномной организации, такие как наличие хромосомных территорий и льготные ассоциации малых генов богатых хромосом. Корреляционный анализ может быть применен к контакт матрицы, демонстрируя, что геном человека разделены на два отсека: менее плотно упакованные отсеке содержащего открытые, доступные и активного хроматина и более плотным отсеке содержащего закрыта, недоступна, и неактивным хроматином регионах. Наконец, ансамбль анализ контактов матрицу, в сочетании с теоретические построения и вычислительной моделирования, показали, что в масштабе megabase Привет-C показывает функции в соответствии с фрактальной конформации глобулы.

протокол

Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Либерман-Aiden и соавт., 326 Наука, 289-293 (2009) .

И. Сшивание, пищеварение, Маркировка ДНК заканчивается, и Блант конца Лигирование

1. Привет-C начинается с сшивания клеток, которая красной нитью среди всех 3C-методов. Во-первых, растут от 2 х 10 ⁷ и 2,5 х 10 ⁷ клеток млекопитающих, либо приверженец или в суспензии, и сшивки клеток. (Подробнее о сшивания клеток, см.: ¹¹
2. Lyse клеток в 550 мкл lysisbuffer (500 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ NaCl, 0,2% Igepal CA-630 и 50 мкл ингибитора протеазы) с помощью гомогенизатора. Спиновые хроматина при 5000 оборотах в минуту и ​​мыть гранул в два раза с 500 мкл 1x NEBuffer 2.
3. Ресуспендируют хроматина в 1x NEBuffer 2, аликвоту на 5 пронумерованных труб и добавить 1x NEBuffer 2 до конечного объема 362 мкл. Добавить 38 мкл 1% SDS, тщательно перемешать и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 10 минут. Место трубы обратно на лед сразу после инкубации.
4. Quench SDS путем добавления 44 мкл Тритон Х-100 и тщательно перемешать. Дайджест хроматина путем добавления 400 единиц HindIII и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи при вращении.
5. Следующие шаги Привет-С конкретными и включают в себя маркировку ДНК заканчивается биотин и выполнения тупой конец перевязки сшитые фрагменты. Этот шаг позволит перевязки переходы, чтобы очиститься позже. Труба 1, не должны подвергаться биотинилирование шаг и вместо этого должны храниться отдельно и служат 3C контроля для обеспечения пищеварения, и перевязка условия были оптимальны.
6. Для заполнения свесы рестрикционных фрагментов и отметить ДНК заканчивается биотина в оставшиеся 4 трубок, добавить 1,5 мкл 10 мМ дАТФ, 1,5 мкл 10 мМ дГТФ, 1,5 мкл 10 мМ dTTP, 37,5 мкл 0,4 мМ биотин-14-дЦТФ, и 10 мкл 5U/μl Кленова к трубкам 2-5. Тщательно перемешать и выдержать в течение 45 минут при температуре 37 ° C.
7. Место труб на льду. Для инактивации ферментов, добавить 86 мкл 10% SDS к трубкам 1-5. Инкубировать пробирки при 65 ° С в течение ровно 30 минут и разместить их на лед сразу после этого.
8. Перевязка осуществляется в чрезвычайно разбавленном условия для того, чтобы пользу перевязки события между сшитых фрагментов. Работа на лед, добавляют 7,61 мл смеси лигирования [745 мкл 10% Triton X-100, 745 мкл 10х буфера лигирования (500 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl _2, 100 мМ DTT), 80 мкл 10 мг / мл BSA , 80 мкл 100 мМ АТР и 5,96 мл воды] для каждого из пяти пронумерованных 15 мл пробирок. Передача каждого переваривается хроматина смеси соответствующих 15 мл трубки.
9. Для постоянных 3C перевязки, добавить 10 мкл 1U/μl T4 ДНК-лигазы к трубе 1. Для тупого конца Привет-C труб, добавить 50 мкл 1U/μl T4 ДНК-лигазы к трубкам 2-5. Смешайте путем обращения труб и инкубировать все 5 труб в течение 4 часов при 16 ° C.
10. Ссылка по теме меняются местами и белка снижается добавлением 50 мкл 10 мг / мл протеиназы К в трубку и инкубации труб в течение ночи при температуре 65 ° C. Добавить дополнительные 50 мкл 10 мг / мл протеиназы К в трубке на следующий день и продолжить инкубации при температуре 65 ° C в течение еще 2 часов.
11. Прохладный реакционной смеси до комнатной температуры и передавать их на пять 50 мл конические пробирки. Purify ДНК в этих труб, выполняя фенольной экстракции. Добавьте 10 мл фенола рН 8,0 и вихревые течение 2 минут. Спиновые труб в течение 10 минут при 3500 оборотах в минуту и ​​тщательно передачи столько водной фазе насколько возможно, чтобы новые 50 мл трубки.
12. Повторите экстракции с использованием фенола рН 8,0: хлороформ (1:1) и осадок ДНК с использованием этилового спирта. (Подробнее о очистки ДНК, см.: ¹¹
13. После центрифугирования ДНК осаждали этанолом, растворить каждый шарик ДНК в 450 мкл 1x TE (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Передача ДНК смесь до 1,7 трубки центрифуги мл.
14. Очередной раунд очистки осуществляется делаем 2 фенол: хлороформ экстракции. Добавить 500 мкл фенола рН 8,0: хлороформ (1:1) и вихревые течение 1 минуты. Центрифуги трубы в течение 5 минут при 14000 оборотах в минуту и ​​передачи водной фазы в новую пробирку. После второго добычи, осадок ДНК, добавив 0.1x объема NaOAc, 2x объеме 100% этанола и инкубировать 30 минут при температуре -80 ° C.
15. После спиннинг вниз осаждали ДНК, мыть каждый ДНК гранул с 70% этанола и ресуспендирования каждый шарик ДНК в 25 мкл ТЕ-1x. Ослабить любой РНК, которые могут присутствовать, добавляя 1 мкл 1 мг / мл РНКазы на пробирку и инкубации труб в течение 30 минут при температуре 37 ° C. Бассейн Привет-C содержимое трубы 2-5, все еще держа трубку 1 отдельный как 3C контроль.
16. Теперь это хорошая возможность для изучения Привет-C маркировки и перевязки эффективности. Эти элементы управления являются отличные показатели ли Привет-C библиотека будет успешным.
    1. Для проверки качества и количества библиотек, запустить 2 мкл и 6 мкл аликвоты 1:10 разведения с обеих 3C и Привет-C библиотек на 0,8% агарозном геле. (См. рисунок 2А)
    2. Привет-C маркировки и Привет-C перевязки эффективность подтверждается ПЦР переварить. Успешное заполните и перевязки сайт HindIII (AAGCTT) создает сайт для рестриктазы NheI (GCTAGC). Конкретного продукта лигирования образуется из двух соседних фрагментов ограничение усиливается с ПЦР (как в 3C 11 использованием 0,2 мкл каждой библиотеки в качестве шаблона. ПЦР продукты впоследствии переваривали HindIII, NheI или обоих. После запуска образцов на 2% гель , относительное число 3C и Привет-C события перевязки можно оценить количественно интенсивность вырезать и режиссерский полос (см. Рисунок 2B).
17. Некоторые фрагменты не были перевязаны: чтобы избежать потянув их вниз позже, биотин удалить из этих unligated концов использованием экзонуклеазная деятельности T4 ДНК-полимеразы.
    1. Биотин-14-дЦТФ при не лигируют концы ДНК удаляется с экзонуклеазная активность Т4 ДНК-полимеразы. Смешайте 5 мкг Привет-C библиотека с 1 мкл 10 мг / мл BSA, 10 мкл 10x NEBuffer 2, 1 мкл 10 мМ дАТФ, 1 мкл 10 мМ дГТФ и 5 единиц T4 ДНК-полимеразы в общем объеме 100 мкл и инкубировать смеси при температуре 12 ° С в течение 2 часов. Если возможно, несколько реакций 5 мкг выполняются.
    2. Реакцию останавливают добавлением 2 мкл 0,5 М ЭДТА рН 8,0.
    3. Для очистки ДНК, фенол рН 8,0: хлороформ (1:1) добыча осуществляется последующим осаждением этанолом.
    4. Супернатант отбрасывается и ДНК гранулы ресуспендировали и объединенных в общем объеме 100 мкл воды.

II. Стрижка и размер Выбор

1. Для того, чтобы биотинилированного ДНК подходит для высокой пропускной последовательности, ДНК должна быть стриженой в размере 300-500 пар оснований с Covaris S2 инструмента (рабочий цикл 5, 5 баллов, циклов / разрыву 200, время 60 сек в течение 4 циклов) .
2. Чтобы восстановить стриженой концах ДНК, добавить 14 мкл 10х буфера лигирования, 14 мкл 2,5 мМ дНТФ смеси, 5 мкл T4 ДНК-полимеразы, 5 мкл Т4 полинуклеотидкиназы, 1 мкл ДНК-полимеразы Кленова и 1 мкл воды. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
3. После инкубации, используйте колонку Qiagen MinElute очистить ДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Элюции ДНК дважды с 15 мкл 1x Трис-Low-ЭДТА (TLE: 10 мМ Трис рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА). Затем приложите дАТФ до кончиков 3 'конца ДНК-отремонтировали, добавив 5 мкл 10x NEBuffer2, 10 мкл 1 мМ дАТФ, 2 мкл воды и 3 мкл Кленова (экзо-). Инкубируйте реакции в течение 30 минут при температуре 37 ° C.
4. Для инактивации фрагмента Кленова, инкубировать реакции в течение 20 минут при 65 ° С, а затем прохладной реакции на льду. Использование speedvac, снижение реакции объемы до 20 мкл.
5. Далее, нагрузка ДНК в 1,5% агарозном геле с 1X TAE и запустить в течение 3,5 часов при 80-90В. После окрашивания геля с SYBR зеленый, визуализировать ДНК на DarkReader. Акцизный фрагменты ДНК от 300 до 500 пар оснований и очищать их с добычей Qiagen гель комплект, используя 2-4 столбцов в зависимости от веса геля. Элюции ДНК с 50 мкл 1x TLE.
6. Комбинат элюатов от Qiaquick колонн и принести конечного объема до 300 мкл с 1x TLE. Наконец, определение концентрации ДНК с Квант-IT методом с использованием кубит флуорометр и рассчитать общее количество ДНК.

III. Биотин Pull-вниз и парные-конце последовательности

1. В этой части протокола, перевязка переходы очищенный от ДНК бассейн, что позволяет эффективную идентификацию взаимодействующих фрагментов хроматина парными-конце последовательности. Выполните все последующие шаги в трубах ДНК LoBind.
2. Подготовка шарики для биотин выпадающего промывкой 150 мкл ресуспендировали магнитных шариков стрептавидином в два раза с 400 мкл буфера Tween (ТБ: 5 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,5 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, 0,05% Твин).
   Эти и будущие моет состоять из пяти этапов:
   1. Добавить буфер для бусин
   2. Передача смеси в новую пробирку
   3. Поворот образца в течение 3 минут при комнатной температуре
   4. Reclaim бусин с помощью магнитного концентратора частиц
   5. Удалить супернатант
3. Ресуспендируют бисером в 300 мкл 2x Нет буфера Tween (2x НТБ: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 2 М NaCl) и смешать с 300 мкл Привет-C ДНК. Разрешить биотин помечены Привет-C ДНК связывается с стрептавидином бусин путем инкубирования смеси при комнатной температуре в течение 15 минут с вращением.
4. Reclaim ДНК связаны стрептавидин бусин с магнитным concentr частицратора, и удалите супернатант. Вымойте бисером в 400 мкл 1x НТБ (5 мМ Трис-HCl рН 8,0, 0,5 мМ ЭДТА, 1 М NaCl), затем 100 мкл буфера 1x труб. Ресуспендируют бусины в 50 мкл буфера 1x перевязки и передачи смесь новой трубки.
5. Для подготовки ДНК для Illumina парные Конец последовательности, принимают общее количество ДНК используются в качестве входных для биотин выпадающее, которое было рассчитано ранее в шаге 2.6, и разделите его на 20, чтобы оценить объем Привет-C ДНК, которая была разобрана и доступна для труб. Добавить 6 пикомолей из Illumina Парные End адаптеров на мкг Привет-C ДНК для труб. Используйте 1200 единиц T4 ДНК-лигазы, чтобы перевязывать адаптеров для ДНК. Инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре.
6. Удалить без лигируют Парные адаптеры End по рекультивации Привет-С ДНК связаны бисера и бусин мытье в два раза с 400 мкл 1x ТБ.
7. Вымойте бисер с 200 мкл НТБ 1x, затем по 200 мкл, а затем 50 мкл 1x NEBuffer 2. После последней стирки, ресуспендируют бусины в 50 мкл 1x NEBuffer 2 и переход к новой трубки.
8. Чтобы определить число циклов, необходимых для создания достаточного продукта ПЦР для секвенирования, созданы четыре ПЦР реакции с 6, 9, 12 или 15 циклов. (Подробности ПЦР-амплификации, см.: 12 Определите оптимальное количество циклов, запустив ПЦР на 5% полиакриламидном геле и окрашивания SYBR Green, гарантируя отсутствие ложных полос и наличие мазка между 400 -. 600 пар оснований, который является длина стриженой продукции после перевязки в адаптерах.
9. Amplify остальное Привет-C-библиотеку связанного бисером стрептавидином в крупномасштабных ПЦР с Оптимальное число циклов ПЦР. Бассейн ПЦР продуктов из отдельных скважин и вернуть бусы. Держите 1% от больших масштабах продукта ПЦР отдельных работать на геле и очищают остатки продукта ПЦР с 1.8x бисером Ampure объеме в соответствии с рекомендациями производителя.
10. Элюции ДНК с 50 мкл буфера 1x TLE и сравнить 1% Ampure бусинка продукт очищают ПЦР на 1% аликвоту оригинального продукта ПЦР на 5% полиакриламидном геле, обеспечивая успешное удаление ПЦР праймеров.
    1. Мы также рекомендуем клонирования 1 мкл Привет-C библиотеки и определения продукта около 100 клонов использованием Сэнгер секвенирования. Это позволит вам оценить относительное число alignable Привет-C говорится в смеси ПЦР. Для типичных результатов, см. рис 3B.
11. Последовательность Привет-C библиотека с Illumina парные конце последовательности. Совместите каждого конца независимо, используя Maq (http://maq.sourceforge.net/) для выявления взаимодействующих фрагментов хроматина.

IV. Представитель Привет-C результаты

1. Ожидаются следующие результаты, когда Привет-C протокол выполнен технически хорошо и может рассматриваться стандартов контроля качества.
2. Шаги по контролю качества должны показать, что оба 3C и Привет-C библиотеки работать как довольно жесткие полосы размером более 10 кб. ДНК мазка указывает на плохую эффективность труб. Как правило, перевязка эффективность несколько ниже, в Привет-C библиотеки по сравнению с 3C шаблон (см. Рисунок 2А).
3. Привет-C маркировки и перевязки эффективность можно оценить по переваривания ПЦР-продукт создан с помощью 3C праймеров. 3C переходы сокращены на HindIII, а не NheI. Обратное верно для Привет-C переходов. Этот анализ ПЦР переварить показывает, что 70% Привет-C ампликонов прорезаны NheI а не HindIII, подтверждающих эффективную маркировку лигирования узлов (см. Рисунок 2B).
4. Анализ последовательности читает должны показать, что читает из обоих intrachromosomal и interchromosomal взаимодействия, обозначенные синими и красными линиями, выровнять значительно ближе к сайтам HindIII ограничения по сравнению с случайным образом читает, показаны зеленым цветом (см. рис 3А).
5. В успешном эксперименте, 55% alignable читать пары представляют interchromosomal взаимодействий. Пятнадцать процентов представляют intrachromosomal взаимодействий между фрагментами менее 20 кб друг от друга и 30% intrachromosomal читать пар, которые более чем на 20 кб друг от друга (рис. 3В). Это распределение может производиться отбор проб до высокой пропускной последовательности, как одна из форм контроля качества; клонирования и секвенирования Сэнгер около 100 клонов, как правило, достаточно.
6. Хроматина взаимодействий можно представить как Тепловая карта, где х-и у-осям отложены в геномных локусов порядка и каждый пиксель представляет число наблюдаемых взаимодействий между ними. Как правило, фрагменты ДНК, которые очень близки друг к другу в линейной генома будет иметь тенденцию к часто взаимодействуют друг с другом. Это видно из intrachromosomal heatmaps как выдающийся диагонали (см. рисунок 4А).
7. Следующие результаты показывают различные способы анализа данных для обнаружения различных уровней организации генома. Построение контакт probabilitгод против геномной расстояния (см. рис 5А) показывает, что вероятность контакта уменьшается в зависимости от геномных расстояния, в конечном счете достигая плато. На каждом расстоянии, intrachromosomal взаимодействия, показанный на сплошной линией, обогащены относительно interchromosomal взаимодействия, представлены пунктирными линиями. Отсюда сразу следует, наличие хромосомных территорий.
8. Расчет наблюдается / ожидаемое количество interchromosomal контактов между всеми парами хромосом показывает льготных ассоциации между отдельными парами хромосом. Малый ген богатого хромосом преимущественно взаимодействуют друг с другом, с указанием ярко-красного цвета (см. рис 5B).
9. Индивидуальные хромосомы могут также быть исследованы. Тепловая карта сырье можно регулировать при помощи ожидается Тепловая карта для учета геномной расстояние между парами локусов, в результате чего наблюдается / ожидаемые Тепловая карта. Затем, корреляционной матрицы могут быть произведены путем сопоставления строк и столбцов наблюдается / ожидаемые heatmaps. Использование корреляционного анализа, показано, что человеческий геном выделяет на два отсека. Это иллюстрируется плед-шаблон в соотношении heatmaps (см. рис 4A-D). (Подробности Привет-C анализа данных, см.: ^1.
10. Использование Привет-C данные, новые идеи были получены в хроматина складной на megabase масштабе. Классическая модель полимера конденсации хроматина позволяет предположить, что пакеты в равновесии глобулы. Построение контакт вероятности в зависимости от расстояния показывает, что масштабы контакт вероятности степенному закону с геномной расстояние, наклон которой составляет около -1 (см. рис 6А). Это не согласуется с поведением равновесия глобулы, но совпадает с ожиданиями альтернативные структуры, известной как фрактальной глобулы (рис. 6Б).
11. Здесь, двух шаровых структур показано на рисунке. Окраска соответствует расстояние от одной конечной точки, начиная с синего на голубой, зеленый, желтый, оранжевый и красный (См. Рис 6C сверху). В отличие от равновесия шариков, фрактальной глобулы отсутствие заграждений. В фрактальной глобулы, локусов, которые находятся неподалеку вдоль контура, как правило, неподалеку, в 3D, что приводит к присутствии монохроматической блоки (см. Рис 6C посередине). Такие блоки не найдены в равновесии глобулы (рис. 6C внизу).

Рисунок 1. Привет-C обзор. Клетки сшитого с формальдегидом, в результате чего ковалентные связи между пространственно смежных сегментов хроматина (ДНК фрагментов: темно-синий, красный; Белки, который может выступить посредником такие взаимодействия, представлены в светло-голубой и голубой). Хроматина, переваривают рестрикции (здесь, HindIII; ограничение сайт: пунктирная линия, см. вставку). В результате липких концов заполняются нуклеотидов, одним из которых является биотинилированного (фиолетовые точки). Лигирование производится в чрезвычайно разбавленном условия, благоприятные для внутримолекулярных событий перевязки; сайт HindIII теряется и сайт NheI создается (вставка). ДНК очищали и обрезается, и биотинилированного переходы выделен с использованием стрептавидина бисером. Взаимодействие фрагменты идентифицированы парных конце последовательности.

Рисунок 2. Привет-C управления библиотекой качества. (А) Увеличение количества 3C контроль и Привет-C библиотеки решались на 0,8% агарозном геле. Обе библиотеки работать как довольно жесткий диапазон более 10 кб. Типичная эффективность лигирования в Привет-C библиотеке несколько ниже, чем то, что наблюдается в 3C шаблон, и указывается в мазке Привет-C переулков. (B) ПЦР переварить контроля. Перевязка узел образован двумя близлежащих фрагментов усиливается использованием стандартных 3C ПЦР условиях. Привет-C продукты лигирования можно отличить от тех, в обычных 3C по перевариванию перевязки сайта. Привет-C переходы сокращены на NheI, не HindIII; обратное верно для 3C переходов. 70% Привет-C ампликонов были сокращены на NheI, подтверждающих эффективную маркировку лигирования перехода. Два Были проведены серии для обеспечения надежной количественной оценке.

Рисунок 3. Привет-C читать контроля качества. () Читает из фрагменты, соответствующие как intrachromosomal (синий) и interchromosomal (красный) взаимодействия выровнять значительно ближе к сайтам HindIII ограничения по сравнению с случайным образом читает (зеленый). Оба intrachromosomal читает и читает interchromosomal кривые быстро убывают по мере удаления от увеличения HindIII сайта, пока не будет достигнуто плато, на расстоянии ~ 500 б.п.. Это соответствует максимальный размер фрагмента использовали для секвенирования. (Б) Как правило, 55% alignable читать пары представляют interchromosomal взаимодействий. Пятнадцать процентов представляют intrachromosomal взаимодействий между фрагментами менее 20 кбдруг от друга и 30% intrachromosomal читать пар, которые более чем на 20 кб друг от друга. Это распределение может производиться отбор проб до высокой пропускной последовательности, как одна из форм контроля качества; клонирования и секвенирования Сэнгер около 100 клонов, как правило, достаточно.

Рисунок 4. Корреляционный анализ показывает, что ядра разделены на два отсека. (А) Тепловая карта соответствует intrachromosomal взаимодействия на хромосоме 14. Каждый пиксель представляет все взаимодействия между 1-Мб локус и еще 1-Мб локус, интенсивность соответствует общее число операций чтения (диапазон: 0-200 читает). Деления появляются каждые 10 Мб. Тепловая карта экспонатов подструктуру в виде интенсивных диагонали и созвездие крупных блоков. (Хромосома 14 является акроцентрических;. Коротком плече не показан) Использование Привет-C набор данных, чтобы вычислить среднюю вероятность контакта для пары локусов в данный геномной расстояние, ожидание матрицы производится (B), соответствующие тому, что было бы наблюдается, если бы не было дальнего структур. Фактор этих двух матриц наблюдается / ожидаемые матрицы (С), где истощение показаны синим цветом и обогащения в красном [диапазон: 0,2 (синий) до 5 (красный)]. Блок картина становится все более очевидной. Корреляционной матрицы (D) иллюстрирует соотношение [диапазон: -1 (синий) до 1 (красный)] между intrachromosomal профили взаимодействия каждой пары локусов по хромосоме 14. Важная тенденция плед указывает на наличие двух отсеков внутри хромосомы.

Рисунок 5. Присутствия и организации хромосом территорий. () Вероятность контакта уменьшается в зависимости от расстояния геномной на хромосоме 1, в конечном счете достигая плато на ~ 90MB (синий). Уровень interchromosomal контакт (черный тире) отличается для разных пар хромосом, локусов на хромосоме 1, скорее всего, взаимодействие с локусами на хромосоме 10 (зеленые штрихи) и меньше всего взаимодействовать с локусами на хромосоме 21 (красный тире). Interchromosomal взаимодействия обедненным по сравнению с intrachromosomal взаимодействий. (B) Наблюдаемое / Ожидаемое число interchromosomal контактов между всеми парами хромосом. Красный цвет означает обогащение, и синий указывает истощение [диапазон: 0,5 (синий) до 2 (красный)]. Маленький, ген богатого хромосом, как правило, более активно взаимодействовать друг с другом.

Рисунок 6. Местные упаковки хроматина согласуется с поведением фрактальной глобулы. () Связаться с вероятностью в зависимости от геномных расстояние, усредненное по всему геному (синий). Известный закон подобия власть видела между 500кб и 7Mb (заштрихованная область) с наклоном -1,08 (приступа показано в голубой). (B) Результаты моделирования для контакта вероятности в зависимости от расстояния для равновесия (красный) и фрактальной (синий) глобул. Склон для фрактальной глобулы очень близка к -1 (голубой), что подтверждает наш роман теоретическое предсказание ^1. Склон для равновесия глобула -3 / 2, что соответствует до теоретическими ожиданиями. Склон для фрактальной глобулы напоминает склоне наблюдается в Привет-C результаты, тогда как склон для равновесия глобула не видел в Привет-C данные. (C) Лучшие: развернулась полимерной цепи, 4000 мономеров долго. Окраска соответствует расстояние от одной конечной точки, начиная с синего на голубой, зеленый, желтый, оранжевый и красный Ближнего:. Типичный пример фрактальной глобулы сделать из нашего ансамбля. Фрактальная глобулы отсутствие заграждений. Локусов, которые находятся неподалеку вдоль контура, как правило, неподалеку, в 3D, что приводит к Присутствие большого монохроматического блоки, которые видны на поверхности и в поперечном сечении Внизу:. Равновесия глобулы. Структура является очень запутанными; локусов, которые находятся неподалеку по контуру (по аналогии цвета) не должны быть рядом в 3D.

Обсуждение

Мы представляем метод изучения 3-мерные архитектуры генома путем сопоставления хроматина взаимодействий в объективной, генома образом. Наиболее важных экспериментальных шагом то, что отличает эту технологию, кроме предыдущей работы - это включение биотинилированного нуклеотидов на ограничение концы сшитого фрагменты перед тупой конец труб. Выполнение этого шага позволяет успешно глубокие секвенирования всех лигирование узлов, и дает Привет-C ее объем и мощность.

Количество читателей в конечном счете определит разрешение взаимодействия карт. Здесь 1 Мб взаимодействия карту генома человека представляется с использованием ~ 30 млн alignable говорится в сообщении. Для того, чтобы увеличить разрешение «универсальный» с коэффициентом п, число операций чтения должны быть увеличены на коэффициент N ^2.

Привет-C методика может быть легко сочетается с другими методами, такими как гибридный захват за поколением библиотеки (для решения конкретных частях генома) и хроматин иммунопреципитации после перевязки (для изучения хроматина среды областей, связанных со специфическими белками).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease inhibitors	Sigma-Aldrich	P8340-5ml	Step 1.2
biotin-14-dCTP	Invitrogen	19518-018	Step 1.6
Klenow	New England Biolabs	M0210	Steps 1.6 and 2.2
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224	Step 1.9
T4 DNA polymerase	New England Biolabs	M0203	Steps 1.17 and 2.2
10x ligation buffer	New England Biolabs	B0202	Steps 2.2 and 3.4
T4 PNK	New England Biolabs	M0201	Step 2.2
Klenow (exo-)	New England Biolabs	M0212	Step 2.3
Dynabeads MyOne Streptavin C1 Beads	Invitrogen	650.01	Step 3.2
T4 DNA ligase HC	Enzymatics	L603-HC-L	Step 3.5
Phusion HF mastermix	New England Biolabs	F531	Step 3.8
Ampure beads	Beckman Coulter Inc.	A2915	Step 3.9