Дефектные Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI в поле дефектов в процессе прогрессии к раку толстой кишки

Резюме

Уменьшение / отсутствует выражение Pms2 и / или ERCC1 во всем склепов является частым событием в пределах 10 см с каждой стороны толстой аденокарциномы, вероятно основе полей дефектов с высокой изменчивости и прогрессии рака. Недостаток Ku86 или CcOI гораздо реже в этих полей дефектов.

Аннотация

В канцерогенеза, "поле дефекта» признана клинически из-за высокой склонности людей, переживших некоторых видов рака для развития других злокачественных новообразований того же типа ткани, часто в близлежащие места. Такие дефекты поля были указаны в рак толстой кишки. Молекулярные нарушения, которые отвечают за полем дефекта в толстой кишке, должны быть обнаружены при высокой частоте в гистологически нормальной ткани вокруг толстой аденокарцинома или окружающих аденомы с передовыми неоплазии (а по дороге на рак толстой кишки), но на низких частотах В слизистой оболочки толстой кишки у пациентов без толстого неоплазии.

Использование иммуногистохимии, целые склепы в пределах 10 см с каждой стороны толстой аденокарциномы толстой или расширенный новообразований оказались часто снижение или отсутствие в выражении в течение двух репарации ДНК белков, Pms2 и / или ERCC1. Pms2 является двойной роли белков, активных в восстановлении ДНК несоответствие, а также необходимые в апоптоз клеток с избыточным повреждения ДНК. ERCC1 принимает активное участие в нуклеотидов ДНК репарации. Снижение или отсутствие экспрессии как ERCC1 и Pms2 создаст клеток с обеих увеличить способность к выживанию (апоптоз сопротивление) и повышенный уровень изменчивости. Снижение или отсутствие экспрессии как ERCC1 и Pms2, скорее всего, первым шагом в прогрессии рака толстой кишки.

Репарации ДНК гена Ku86 (активные в ДНК негомологичными конце присоединения) и цитохром с оксидазы субъединицы I (участие в апоптозе) каждого из которых сообщалось, снизилась в выражение в слизистой районах, близких к рака толстой кишки. Тем не менее, иммуногистохимического оценки их уровень экспрессии показали только от низкого до скромных частотах склепы испытывают дефицит свое выражение в поле дефекта окружающих рака толстой кишки или окружающих передовых толстой неоплазии.

Мы покажем, вот, наш метод оценки склепы для выражения ERCC1, Pms2, Ku86 и CcOI. Показано, что частота целых склепы недостаточно для Pms2 и ERCC1 часто столь же велика, как 70% до 95% в 20 см длиной районах, прилегающих к толстой неоплазии, в то время как частота склепы дефицит Ku86 имеет среднее значение 2%, а частота склепы дефицит CcOI имеет среднее значение 16% в этих областях. Всей толстой кишки составляет 150 см (5 футов) и имеет около 10 миллионов склепов в его слизистой оболочки. Дефект Pms2 и ERCC1 окружающих рака толстой кишки таким образом может включать в себя 1 млн склепов. Именно с дефектными склепе, что рак толстой кишки возникает.

протокол

Подготовка тканей для просмотра на слайдах

1. Колоноскоп может быть передан в толстую кишку через прямую кишку. Колоноскоп длинную трубку, которая освещение и видео камеры на голове, способность пропускать воздух в толстую кишку, чтобы взорвать его как длинный воздушный шар для улучшения визуализации толстой кишки, и имеет проход для щипцы биопсии, которые могут выходят за рамки видеокамеру, чтобы отщипывать 3-5 миллиметра области внутренней поверхности "кожи" или слизистой оболочки толстой кишки, чтобы дать нам биопсии. Биопсия пинцет может также быть использована для удаления потенциально предраковые полипы обнаружены в толстой кишке.
2. Мы получили биопсии слизистой оболочки толстой нормальных тканей от пациентов, с информированного согласия. Эти пациенты проходили обследование колоноскопию в желудочно-кишечном клинике. Наши биопсии были размещены в банках формалина. После 4-х часов, формалин был заменен на 70% спирте.
3. Подобные образцы ткани были взяты из области толстой кишки резекции, удалены во время операции, которые были 1 см и 10 см от рака толстой кишки или аденомы с передовыми неоплазии. Эти образцы ткани были размещены в формалине, и если образцы ткани были большими, некоторые держали в формалине в течение более длительного периода, прежде чем поместить в 70% спирте.
4. Образцы тканей принимаются для лаборатории гистологии для обработки и помещены в парафиновых блоков.
5. Парафиновые блоки охлажденным в холодильнике, чтобы сделать их более легко режется по микротоме.
6. Ткань разделах 4 мкм толщины, вырезанных из ткани блоков, используя микротома, и поплыл по воде.
7. Для сравнения выражение из двух белков, например ERCC1 и Pms2, альтернативные разделы ткани можно забрать на два слайда, пока Есть три срезах тканей на каждом из двух слайдов. Например, разделы 1, 3 и 5 могут быть размещены на одном слайде помечены ERCC1 и разделы 2, 4 и 6 могут быть размещены на одном слайде помечены Pms2. После трех разделов ткани immunostained для одного белка на одном слайде может позволить вам увидеть, если необычный характер окрашивания склеп артефакт или реально, так как артефакты не повторится в более чем одном срез ткани на слайде. Колон склепы около 60 мкм в диаметре, так что около 15 разделов ткани могут быть сокращены через один склеп, и тот же склепе можно рассматривать на нескольких разделах ткани на слайд.

Иммуноокрашивание срезах тканей

1. Слайды, затем положить через иммуногистохимического процедуру маркировки. Это 8-часовой процедуре и является довольно стандартным. Части процедуры, которые мы используем, которые не являются стандартными, являются использование контейнеров Sequenza для окрашивания, а также использование решение для уменьшения фонового окрашивания называется "Снайпер". "Снайпер" решение продают как собственные формулы Biocare Medical, Concord CA.
2. Некоторые из шагов нашей процедуры показаны здесь.
3. Как, например, для Pms2 иммуногистохимии, слайды, прежде deparaffinized путем размещения в 3 смены ксилола (3 минуты), затем следуют два изменения в 100% этанолом (2 минуты), затем следуют два изменения в 95% этаноле (2 минуты каждый), затем 2 изменений дистиллированной воды (2 минуты каждый). Эти процедуры осуществляются по химической капюшон с отрицательным давлением воздуха, так что экспериментатор не подвергается воздействию паров.
4. Когда формалина изначально используется для фиксации ткани, части белков в образце ткани стали сшитого. Теперь нам нужно разорвать поперечные связи, так что антитела могут распознавать белок. Слайды помещаются в буфер решение, которое доводится до кипения в микроволновой печи. Далее следуют 10 минут на среднем уровне, с последующим охлаждением в течение 20 минут на льду. Этот этап должен быть проверен и с поправкой на различные микроволновые печи, пока хорошие результаты. Заметим, что для иммунной CcOI или Ku86 мы использовали буфер цитрат натрия сделаны с 9mL лимонная кислота + 41mL цитрат натрия + 450 мл H ₂ O (буфера в том числе ионов натрия), которые рН около 6,0, для ERCC1 мы использовали цитрат буфера сделал с 2.1g лимонной кислоты + 1 литр H ₂ O + ~ 5 мл раствора гидроксида натрия, чтобы довести рН до 6,1 (буфер с минимальными добавил ионов натрия), а для Pms2 мы использовали решение сделаны с 5 мл раствор Разоблачение антиген (по VECTOR) + 533mL H ₂ O. Различные буфера, необходимого для увеличения антител взаимодействия с особым эпитопов белка.
5. Слайды, затем положить на 3% перекиси водорода (разбавленный в метиловом спирте) в течение 20 минут с последующим промыть в дистиллированной воде в течение 3 минут, и промывают в фосфатно-солевом буфере (PBS называется) в течение 5 минут.
6. Слайды затем помещаются в плоские узкие стойки окрашивания называют Sequenza (Shandon Sequenza Иммуноокрашивание системы от компании Thermo Scientific) и промывали PBS.
7. Слайды быть immunostained для ERCC1 или Pms2 которые затем подвергаются до 10 минУтес воздействия добавил лечение 3 капли собственное решение, полученное из Biocare, называется "Снайпер", который действует уменьшить неспецифическое окрашивание фона белков.
8. Слайды промыть буфера "TBST", которая составляет 1 мл твин + 100 мл Трис 10x + 900 мл дистиллированной воды [где 10x Трис составляет 24,2 грамма Trizma + 80 граммов NaCl + 1000 мл дистиллированной и деионизированной воды + концентрированной соляной кислоты (приблизительно 15 мл), чтобы довести решение до рН 7,6].
9. Слайды затем промывают три раза буфером, и 100 мкл биотинилированного DAKO вторичными антителами в разведении 1:100 (в 2% бычьего сывороточного альбумина составила в буфере TBST) добавляется к слайдам и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.
10. На данный момент, Vectastain ABC (авидин Биотин комплекс) (от Vector Laboratories) реагента готовят, используя 2,5 мл PBS, 1 капля решение, по 1 капле раствор B, и раствор оставляют на 30 минут.
11. Слайды промыть 3 раза TBST буфера.
12. Затем 3 капли реагента Vectastain ABC добавляется и слайды инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут с последующей промывкой в ​​2 раза с TBST.
13. Слайды затем погружали в DAB (диамино-бензамида) (2,9 мл DAB + 400 мкл PBS + 250 мкл перекиси водорода) в течение приблизительно 5 минут.
14. Слайды затем промыть 2 раза дистиллированной, деионизированной воды.
15. Counterstaining делается с разбавленным раствором гематоксилином в течение 10 секунд. Слайды промыть тщательно в водопроводной водой, а затем деионизированной водой.
16. Слайды то обезвоженной 2 раза по 2 минуты в 95% этанола, 2 раза в течение 2 минут в 100% этанола и 2 раза по 2 минуты в ксилоле.
17. Пару капель Cytoseal XYL (Richard Allan Научно-) затем добавляется в слайды и покровного применяется.
18. Иммуногистохимическое оценки ERCC1, Ku86 и CcOI выполняются с помощью же протокол, что для Pms2, но заменить Pms2 антител с антителами для ERCC1, Ku86 и CcOI описаны в таблице ниже.

Оценка срезах тканей для склепы дефицит выражение ERCC1, Pms2, Ku86 и CcOI

1. Мы рассмотрим сначала в срезах тканей под Motic (DM-BA300) photomicroscope для выражения Pms2 и ERCC1 в криптах слизистой оболочки толстой кишки.
2. Pms2 и ERCC1 являются ферменты репарации ДНК, и поэтому они находятся там, где ДНК в ядрах клеток крипт. Это показано на рисунке 1, где коричневые толстой кишки представляющих для окрашивания ERCC1, происходит в ядрах клеток в склепе. Нормальные склеп покажем сначала в микроскоп был запятнан за ERCC1, и коричневые пятна показано расположение ERCC1. Отметим, типов клеток в склепы, где "бокаловидных клеток" имеют форму несколько как бокал, с ядрами при малой области у основания клетки на внешний край склеп, и выпячивание разделе заполнены белые гранулы муцина в части клетки на внутренней части склепа. Два других типов клеток выглядят несколько, так в нашем окрашенные срезы, и они энтероцитов и enteroendocrine клеток и их ядер, также подвергаются внешнему краю склеп, в основе клеток. В биопсий, взятых у пациентов, которые никогда не была толстой неоплазия, или в биопсии далеко от любого сайта, рака толстой кишки, почти все из ядер во всех склепов демонстрируют нормальное высокий уровень экспрессии ERCC1 как показано здесь.
3. Чтобы сориентироваться нашим наблюдениям, срезах тканей полученные из биопсии пациентов без толстого неоплазии наблюдаются уровень экспрессии Pms2, ERCC1, CcOI или Ku86 в нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Мы можем наблюдать все склепы в нормальном сечении ткани, с 40х объективом, как мы медленно пройти через весь срез ткани и указать на склепы, интерстициальные клетки, любые лимфоидных узелков на слайде, и мышечной (если имеется В биопсия).
4. Отметим также, что Есть только несколько клеток в основании склепа, которые являются стволовыми клетками. Эти стволовые клетки порождают все около 2000 клеткам полный склепе. Стволовых клеток с мутацией или epimutation может взять на себя все ниши стволовых клеток. Тогда весь склеп может изменять окрашивание на фермент интереса (склеп преобразования), как мы покажем в этом новый слайд, где мы видим целые склепы недостаточно для CcOI рядом со склепами, которые имеют высокий уровень экспрессии CcOI.
5. Затем мы показываем слайд из пациентов с раком толстой кишки или аденомы с передовыми неоплазии. На этом слайде, некоторые склепы имеют нормальный высокий уровень экспрессии для ERCC1, а некоторые имеют более низкие уровни экспрессии. Все склепы в срез ткани фотографируются с низким разрешением с 10-кратным объективом, а также изображения выложены плиткой, так что весь срез ткани наблюдается в одно изображение. Склепы затем сочтены.
6. Склепы с высокой экспрессией фермента, характерные для крипт биопсии далеко сюдам любого рака, называют уровне "4" окрашивания. Другие уровни "0", если нет выражения обнаружить, "1", если чуть-чуть экспрессии этого очевидно, "2", если есть выражение присутствует, но на гораздо более низком уровне, чем уровень 4, и "3", если выражение присутствует на уровне ниже 4, но довольно сильный. Мы точка каждого слайда по темно-синего разрешение изображения на 4, зеленый на 3, желтый на 2, оранжевый и красный 1 для 0. Здесь мы показываем, проходя участок от биопсии использовании 40x объектив. Мы точка склепы по низким разрешением изображения.

Рисунок 1. Толстой склеп показывающие высокую экспрессию ERCC1 в ядрах склеп клеток. Все цвета в этом изображении были в равной степени усиливается в контрастности и насыщенности, используя Paint Shop Pro 5.

Представитель Результаты

1. Альтернативных срезах тканей на отдельных слайдов позволяют с уверенностью смотреть в то же толстой склепы, с выражением двух различных протеинов показал иммуногистохимии. Изображение одного склепа окрашивают в течение Pms2 и то же окрашенных склеп для ERCC1 показано на соседних микроскопов со смежными компьютерных мониторов. Это позволяет нам определить, есть ли совместные дефицит в течение двух белков или недостатки в каждом из белков, в то время как каждый из них часто происходит независимо. У нас есть три срезов ткани на слайд, так что любой явный недостаток в экспрессии белка может быть проверена как дефицитный на более чем одном разделе, а не из-за артефакт. В тканях, окружающих рака толстой кишки, где есть поле дефекта порождая рак, есть высокая частота склепы недостаточно для ERCC1 и Pms2.
2. Мы также использовали иммуногистохимии, чтобы найти частоту склепы недостаточно для Ku86 и CcOI. На этом слайде, мы проходим через весь срез ткани immunostained для Ku86, используя 40х объектив, и мы можем видеть, что некоторые склепы являются несовершенными для Ku86 в этой ткани разделе.
3. Кроме того, на этом слайде, мы проходим через весь срез ткани immunostained для CcOI, используя 40х объектив, и мы видим, что только умеренное количество склепов недостаточны для CcOI.

Обсуждение

1. Очень важно иметь 3 срезов ткани на слайд. Пузыри могут возникнуть при применении средств массовой информации проведение антител, так что некоторые склепы или части крипты не может быть адекватно окрашенных только потому, что пузырь предотвратить антитела из реагирующих с срез ткани. Гробницы около 60 мкм в диаметре, и срезах тканей являются 4 микрон, поэтому не может быть больше, чем 15 разделами ткани через тот же склепе. Как правило, можно найти же склепе, с использованием морфологии склепе в качестве руководства, на несколько разделов ткани помещают на предметное стекло.
2. В наших последних исследований, для больших образцов тканей, окрашивание в Sequenza не может дать хороший охват антитела к ткани. В этих случаях, можно предпочитает использовать ручной окраски ткани, где капля средах, содержащих антитела ручной размещены на каждый образец ткани.
3. Чтобы ясно видеть, коричневого окрашивания показывает выражение immunostained белка и синего окрашивания показывает ядерной ДНК на мониторе компьютера, программное обеспечение Motic photomicroscope регулируется следующим образом: Gain 0, смещение 0, расширение 0, 255, 1,00 Гамма, 0, Резкость 1, цветокоррекция 7, R, G, B Gain 1,00 и R, G, B Яркость 0. Установлено разрешение на 1024 x 768, и баланс белого включена.
4. Наш метод может быть использован с любым белков считается важным в прогрессии рака толстой кишки, чтобы оценить их частоту дефицита, или, возможно, избыточная экспрессия, в поле дефектов окружающих рака толстой кишки или аденомы с передовыми неоплазии.
   
   
5. Поле дефекты часть прогрессирования рака
   Термин "поле cancerization" был впервые использован Слотер и соавт. В 1953 году ¹ для описания области или «поле» эпителия, которая была обусловлена ​​в значительной степени неизвестны процессы (в то время) так, чтобы она предрасполагает к развитию рака. Первого использования была в контексте рака ротовой полости. С тех пор термин "поле cancerization" и "поле дефекта" были более широко использовать для описания каких-либо предварительных злокачественных тканей, в которых новые рака чаще возникают, и понятие поля cancerization в клинической онкологии уделяется все больше внимания ² . Недавно мы рассмотрели фактические данные для полевых дефектов двенадцатиперстной кишки ^3. Включенные в обзор, были результаты десятков исследований предоставление доказательств поля дефектов в толстой кишке.
   
   Поле дефектов слизистой оболочки толстой кишки, вероятно, возникают в результате естественного отбора мутантных клеток или эпигенетически измененных клеток среди стволовые клетки из склепа, что одна стволовая клетка выживает ⁴ нишу подряд. Генетическая нестабильность или мутатор фенотип, возможно, за счет сокращения нуклеотидов ДНК репарации ДНК или несоответствие ремонта, было бы ускорить этот процесс (и частый дефект Pms2 сообщалось ранее, в районах, прилегающих рака толстой кишки ^5). Если в нормальной популяции стволовых клеток в слизистой оболочки толстой кишки, клетка приобретает селективное преимущество за счет мутации или epimutation, она будет иметь тенденцию к расширению клонально за счет соседних стволовых клеток. В слизистой оболочки толстой кишки, ниши стволовых клеток занимает ≤ 5 клеток ^6, которые затем дают начало всем (около 2000) клеток крипт. Захват ниши стволовых клеток от мутанта или эпигенетически изменен тип клеток приводит к "склеп преобразования" ^7.
   
   Распространения мутировавших клонов (в пересчете склепов) в толстой эпителия могут чаще всего происходят на склеп деления ^8. Примером склеп деления показано на рисунке 2. Таким образом, участок аномальной ткани возникает. В рамках такой патч, вторая такая мутация может произойти так, что данный склеп приобретает преимущество по сравнению с другими склепов в патч, и этот склеп будет расширяться клонально формирования вторичных патч в оригинальной заплаткой. В рамках этого нового патча, процесс может повторяться несколько больше времени, возможно, на протяжении десятилетий, вплоть до злокачественных стволовых клеток возникает клонально который расширяется в рак. Если это общий процесс, при котором отдельные толстой аденокарциномы возникают, то обычно аденокарциномы толстой должен быть связан с, и должна предшествовать, поля аномалий. Таким образом участок преобразован склепов можно было бы ожидать, чтобы обнаружить дефекты в районе, прилегающем аденомы с передовыми неоплазии или окружающих рака толстой кишки.
   
   Из этой модели предварительно опухолевой прогрессии, можно было бы ожидать, чтобы найти генетические или эпигенетические изменения, связанные с предварительной опухолевой прогрессии среди образцов тканей, взятых из неопухолевых слизистой оболочки толстой кишки в районах, прилегающих опухолевых поражений толстой кишки, которые могут прогрессировать до рака . В частности, дефекты ферментов репарации ДНК, или белки, необходимые для апоптоза, будет способствовать прогрессии, увеличивая нестабильность генома, и можно было бы ожидать, чтобы найти в дефектной области.
6. Выбор за дефицита Pms2 когда клетки гeficient для ERCC1 и подвергнут ДНК-повреждающего агента
   Нара и др. ^9. Вырос на 25 культурах клеток китайского яичника хомяка 43-3B, все с мутацией гена инактивации ДНК ремонт ERCC1 и обрабатывают культуры с повреждающим ДНК, MNNG. Среди выживших клетках лечения повреждений ДНК, одна ячейка была выделена из каждой культуры и позволили сформировать клон. Все клоны были изолированы в 10 раз более устойчивы к убийству MNNG, чем родительский штамм. Из клонов изолированные, 22 были доказаны будут обнаружены дефекты в ДНК, коррекционная репарация (MMR). Пять из этих 22 клонов были протестированы с помощью секвенирования, и три из пяти были недостаточно для Pms2. Этот выбор за дефекта в Pms2 был предположительно из-за дефицита Pms2 вызвало сопротивление апоптоз, и, следовательно, способность к выживанию добавил повреждения ДНК в клетках, остальные, когда ERCC1 отсутствовал. (Обычно, Pms2 чувств повреждения ДНК уровнях, и заставляет клетки подвергаются апоптозу при повреждении ДНК является чрезмерным.) Таким образом, дефицит Pms2 выбран для того, когда ERCC1-дефицитных клеток подвергаются повреждения ДНК. Клоны дефектный в обеих ERCC1 и Pms2 были показаны около 500 до 1000 раз больше мутаций при облучении УФ, чем родительских клеток.
   
   
7. Желчные кислоты вызывают окислительный стресс, являются ДНК повреждающих агентов и играют важную роль в прогрессии рака толстой кишки
   Deoxycholic кислоты, желчных кислот, повышает окислительный стресс путем образования активных форм кислорода (АФК) несколько процессов, в том числе повреждение митохондрий ^10. Существует доказательство того, что последние АФК причиной эпигенетические изменения ^11, и по меньшей мере 15 исследований показали, что желчные кислоты, при повышенной концентрации сопровождающих высоким содержанием жиров, вызывают повреждения ДНК ^12. Как рассмотрены Бернштейн и др. ^12. Существует положительная связь между диетическим потреблением жира и частотой рака толстой кишки. Желчные кислоты выделяются в желудочно-кишечном тракте в ответ на жиры в рационе, и желчные кислоты выступают в качестве моющих средств, чтобы помочь в переваривании жиров. Таким образом, высоким содержанием жиров связано с увеличением секреции желчных кислот. Фекальные концентрации желчных кислот повышается в группах населения с высокой частотой рака толстой кишки, и чрезмерное воздействие желчных кислот, считается основным фактором риска развития толстой кишки канцерогенеза ^13. Желчные кислоты могут быть причиной поле дефектов в толстой кишке.

Рисунок 2. Толстой делящихся склепе на 3 склепов.

Заключение

Мы обнаружили высокую частоту склепы дефицит репарации ДНК генов ERCC1 и Pms2 (Pms2 также необходим для апоптоза) в больших дефектов поля, окружающего рака толстой кишки. Недостатки в ERCC1 и Pms2 (из-за эпигенетические изменения или мутации) могут быть первые шаги в генетической нестабильности центральное прогрессирование рака толстой кишки.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMS2 antibody	BD Biosciences	556415
ERCC1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Inc.	MS-671-P1
Ku86 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9034
CcO1 antibody	Invitrogen	459600
Biotinylated secondary	Dako	E0413
22% BSA	Informagen, Inc.	2327
Sniper	Biocare Medical	BS966
Vectastain ABC	Vector Laboratories	PK-6100
DAB	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34001
Tween 20	USB Corp., Affymetrix	20605
Cytoseal XYL	VWR international	48212-196
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503