Быстрое однородных Обнаружение биологических экспериментов с использованием магнитных система биодатчиков модуляции

Резюме

Магнитная система модуляции биодатчиков используется для быстрого, чутко и просто обнаруживать биологические анализы, такие как молекулы ДНК и белков.

Аннотация

Модуляции магнитного биодатчиков системы (ММБ) [1,2] быстро и равномерно обнаружено биологических мишеней при низких концентрациях без мытья или стадии разделения. Когда IL-8 целевых присутствовал, "sandwich' основе анализа прилагается магнитных шариков с IL-8 захвата антитела к стрептавидин связаны флуоресцентного белка с помощью IL-8 цели и биотинилированного IL-8 антител. Магнитного бисер маневрировал в колебательное движение, применяя переменного градиента магнитного поля с помощью двух электромагнитных полюсов. Флуоресцентные белки, которые прилагаются к магнитных шариков конденсируются в области обнаружения и их движение в и из ортогональных лазерный луч производит периодические флуоресцентный сигнал, демодулированный использованием синхронного детектирования. Магнитная система биодатчиков модуляции ранее был использован для выявления кодирующих последовательностей из неструктурных Ибараки вирусного белка 3 (NS3) комплементарной ДНК (кДНК) [2]. Методы, которые демонстрируются в этой работе для внешних манипуляций и конденсации частиц могут быть использованы для других применений, например, поставка магнитно-связанных наркотиков

протокол

ИЛ-8 анализа:

1. Реакционной смеси включены следующие четыре компонента в 100 мкл конечного объема буфера в соответствующих концентрациях. 10 мкл магнитных шариков с захватом антител при 100 бусин / мкл конечных концентрациях, 2 мкл биотинилированного IL-8 антител на 1 nano-gram/μl конечной концентрации, 1 мкл стрептавидин флуоресцентного белка при 20 nano-gram/μl конечной концентрации, и 1 мкл IL-8 цель на 0,48 pico-gram/μl. Компоненты добавляются один за другим буфером и затем встряхивают в течение 30 минут.
2. Контрольной реакции готовят так же, без IL-8 цели.
3. Реакции позже помещен без каких-либо разделения или стиральную шаг в кювет и проверить при помощи MMB системы.

MMB системы:

1. Место кювету в его положение между двумя электромагнитными полюсами.
2. Эксплуатация модуляции тока и подождите 30 секунд, чтобы позволить агрегации и конденсации бисером
3. Измерить сигнал синхронный усилитель с помощью осциллографа.

Представитель Результаты:

Визуальный осмотр агрегированных бисером представили четкое различие между реакцией с мишенью и реакции без цели. Во всех реакциях с мишенью, бусин формируется единый плотный агрегат, который переехал в и из лазерного луча таким образом, объединиться. Однако во всех реакции без цели, бусины были менее агрегированных и их движение было менее объединиться (см. Рисунок 1).

Рисунок 1: визуальный осмотр иммуноанализа сэндвич '() без целевой ИЛ-8 (б) с целевой IL-8.

Часы полюс модуляции (желтый) и PMT выходного сигнала (пурпурный) при обнаружении 0,48 грамма пико-IL-8 целевых представлены на рисунке 1 (а). Частота модуляции для каждого полюса с частотой 2 Гц. Однако, как это было теоретически ожидать, когда бусины проходит лазерный луч, PMT обнаруживает флуоресцентный свет, и есть пик в PMT выходного напряжения. Таким образом, демодуляция частоты с частотой 4 Гц. Когда ФЭУ сигнал и удвоил-модуляции частоты (с частотой 4 Гц) подают к замку усилителем, чувствительным детектором фазы обнаруживает синхронизации и результатов с высоким напряжением (см. Рисунок 2).

Рисунок 2: (а) модуляции часы (желтый) и ФЭУ сигнал (пурпурный) при обнаружении 0,48 грамма пико-IL-8 цели. (Б) привели блокировки усилитель напряжения на двух разных сканов.

Замок в усилителе не обнаружили никакого сигнала, когда контрольный образец был испытан. Этот факт, вместе с визуальной разницы в агрегации показывает, что система MMB может точно определить присутствие ИЛ-8 цели.

Обсуждение

Таким образом, мы показали, что система MMB может быть использован для обнаружения присутствия IL-8 целевой при низких концентрациях (0,5 пико грамм предел обнаружения Bio-Plex Precision Pro анализах цитокинов [3,4]). Способность системы не ограничивается IL-8 и может быть использован для обнаружения др?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set	Bio-Rad	171-B5008M
Recombinant human IL-8 target	Thermo Fisher Scientific, Inc.	R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8	BD Biosciences	554718
Streptavidin coupled fluorescent protein	Bio-Rad	Streptavidin PE