В месте субклеточных Фракционирование Приверженец и не соблюдают клетках млекопитающих

Резюме

В месте субклеточных фракционирования клеток млекопитающих на микроскопе покровные позволяет визуализировать белки локализации.

Аннотация

Белки функции тесно связаны с белком локализации. Хотя некоторые белки ограничены в определенном месте или субклеточных отсек, многие белки присутствуют в виде свободно диффундирующих населения в свободном обмене с подгруппы населения, тесно связанный с определенным субклеточных домена или структуры. Натурные субклеточного фракционирования позволяет визуализировать компартментализация белка, а также может выявить белок подгруппах, локализовать к конкретным структурам. Например, удаление растворимых цитоплазматических белков и слабозакрепленных ядерных белков может выявить устойчивые ассоциации некоторых факторов транскрипции с хроматином. Последующие переваривания ДНК может в некоторых случаях выявить связь с сетью белков и РНК, является общее название ядерной эшафот или ядерного матрикса.

Здесь мы опишем шаги, необходимые во время на месте фракционирования сторонник и не сторонник клетках млекопитающих на микроскопе покровные. Белки визуализации можно достичь с помощью специфических антител или флуоресцентных белков слияния и флуоресцентной микроскопии. Антитела и / или флуоресцентными красителями, которые выступают в качестве маркеров для конкретного отделения или структуры позволяют белка локализации быть отображены в деталях. Натурные фракционирования также может быть объединена с западной промокательной сравнить количество белков, присутствующих в каждой фракции. Этот простой биохимический подход может выявить ассоциации, которые могли бы остаться незамеченными.

протокол

I. Подготовка для фракционирования

В этом разделе описывается подготовка поли-L-лизин покрытием покровные микроскопа и прикрепление клеток до фракционирования. При необходимости клетки могут быть временно трансфицированных векторов экспрессии белка до или после вложения.

А. Получение поли-L-лизин покрытием покровные

1. Подготовка решения 1mg/ml поли-L-лизин в дистиллированной воде.
2. Пальто чистой покровные с поли-L-лизин, путем инкубации их в раствор, по крайней мере 1 час на качалке платформы при 22 ° C.
3. Мыть покрытие покровные стерильной дистиллированной водой в два раза и следовать с одной мыть с 96% этанола.
4. Воздух сухой покрытием покровные на кусочек фильтровальной бумаги и держать их в сухом контейнере для использования в будущем (после высыхания они могут быть сложены).

Б. Прикрепление клетки покровных

Номера для прилипшие клетки (здесь мы используем клеток К562)

1. Место поли-L-лизин, покрытой покровным в хорошо в 6-луночный планшет с покрытием вверх.
2. Семенной клеток К562 при плотности 7х10 ^{5 клеток} / лунку в Дульбеко изменения орлы Средняя (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), П. С. (пенициллин 100units/ml, стрептомицин 100мг/мл). В случае клеток К562 временной трансфекции можно выполнить с помощью электропорации (0.4cm электропорации кюветы с 1х10 ^{7 клеток} в 200 мкл среды при 250 В / 975μF) перед посевом клеток.
3. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 ° С в 5% СО _2.
4. Вылейте средних и мыть клетки дважды с ледяной фосфатным буферным раствором (PBS).
5. Следуйте с субклеточных протокол фракционирования.

Приверженец клетки (здесь мы используем Cos-7 клеток)

1. Место немелованной покровное в хорошо в 6-луночный планшет.
2. Мыть два раза в ФБР предварительно нагретого при температуре 37 ° C.
3. Отсоедините клетки путем переваривания трипсином (0,03% ЭДТА, 0,25% трипсина) в PBS при температуре 37 ° С в течение 2 до 5 минут. Важно не переусердствовать-дайджест клетки и остановить пищеварения, как только преимущественно отдельные плавающие клетки присутствуют.
4. Стоп пищеварения путем посева клеток на плотность 3х10 ^{5 клеток} / лунку в 6-луночный планшет в DMEM с добавлением 10% ЭТС и ПСЖ (пенициллин 100 ед / мл, стрептомицин 100ug/ml и L-глютамина 292ug/ml) , на нормальных покровные. Приверженец клетки обычно придают также на нормальном покровные микроскоп, тем не менее, поли-L-лизин покрытием покровные могут быть использованы в случае необходимости.
5. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при температуре 37 ° С и 5% СО _2. В случае Cos-7 клеток временной трансфекции можно выполнить с помощью Fugene 6 (Roche), если требуется, и клетки слева оправиться еще 24 часов при 37 ° C и 5% СО _2.
6. Вылейте средних и мыть клетки дважды с ледяной PBS.
7. Следуйте с субклеточных протокол фракционирования.

II. Субклеточных фракционированием

В месте доли производится по схеме показано на рисунке 1 и основано на методике, описанной ранее ⁵ с изменениями, описанный ранее ⁷ и подробный протокол ниже. Рекомендуется для передачи покровные для свежих 6-луночный планшет после каждого шага фракционирования удаления покровного перед удалением жидкости. Хотя только четыре покровные требуются для работы с изображениями, дополнительные покровные обязаны производить весь экстракт клеток и ядерной фракции матрицы для западных промокательной если это будет выполняться параллельно.

1. Подготовка и фильтр цитоскелета буфер (ЦСК): 10mm ТРУБЫ, 300 Сахароза, 100 мм NaCl, 3 мМ MgCl _2, 1 мМ EGTA. ЦСК буфера должен быть свежеприготовленным в день фракционирования.
2. При необходимости из одной клетки покровного могут быть использованы для подготовки целого экстракт ячейки для западных промокательной, осторожно размещения 200ul TES буфера (1% SDS, 2 мМ EDTA, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4), прямо на покровное и инкубации в течение 1 или 2 минуты при 22 ° C. Весь экстракт ячейка может быть удалена и белки осаждали добавлением 250ul 1М (NH ^{4) 2} SO ⁴ и инкубации на льду, пока другие западные образцы будут готовы.
3. Вымойте оставшиеся покровные с 1 мл ледяной PBS в два раза при 22 ° С, наклоняя 6 хорошо пластины два или три раза.
4. Удалить покровное представляющие целые клетки и трансфер в свежем 6-луночный планшет. Следуйте с фиксацией клеток и иммуно-флуоресценции протокола.
5. Аккуратно снимите PBS от остальных скважин.
6. Извлечение цитоплазматических и слабозакрепленных ядерные белки, осторожно размещения буфера 200ul ЦСК + 0,1% (V / V) Тритон Х-100 непосредственно на каждого оставшегося покровное и инкубации нальда в течение 1 минуты.
7. Удалить цитоплазматических и ядерных слабозакрепленных экстракта и выпадают в осадок, как описано в шаге 2.
8. Вымойте покровные с 1 мл ледяной PBS в два раза при 22 ° С, наклоняя 6 хорошо пластины.
9. Удалить покровное представляющих плотно провели ядерные материалы и пойти с фиксацией клеток и иммуно-флуоресценции протокола.
10. Аккуратно снимите PBS от остальных скважин затем извлечь плотно состоялась белки, осторожно размещения буфера 200ul ЦСК + 0,5% (V / V) Тритон Х-100 непосредственно на каждого оставшегося покровное и инкубации на льду в течение 20 минут.
11. Удалить плотно состоялась экстракта и выпадают в осадок, как описано в шаге 2.
12. Вымойте покровные с 1 мл ледяной PBS в два раза при 22 ° С, наклоняя 6 хорошо пластины.
13. Удалить покровное представляющих хроматина фракции и следовать с фиксацией клеток и иммуно-флуоресценции протокола.
14. Аккуратно снимите PBS от остальных скважин затем поместить 200ul ЦСК буфера + 100ug/ml из ДНКазы я на оставшиеся покровные и инкубировать 30 минут при 37 ° C.
15. Удалить хроматина экстракта и выпадают в осадок, как описано в шаге 2.
16. Вымойте покровные с ледяным PBS в два раза при 22 ° С, наклоняя 6 хорошо пластины.
17. Удалить покровное представляющих ядерной фракции матрицы и следовать с фиксацией клеток и иммуно-флуоресценции протокола.
18. При необходимости матрицу белки могут быть удалены из дополнительных покровное матрицы для западных промокательной использованием буфера 200ul TES, как описано в шаге 2.
19. Образцы для западных пятно должно быть центрифугировали при 13000 оборотов в минуту в настольный микроцентрифужных при 4 ° С и гранулы ресуспендировали в 40ul SDS загрузки буфера (62.5mM Трис-HCl рН 6,8, 2% SDS (м / о), 50 мМ DTT, 10% глицерина, 0,01% бромфенола синий (м / о)) перед анализом на SDS-PAGE.
    
    Рисунок 1. Схематическое изображение на месте субклеточных фракционирования. Цитоскелета буфер (ЦСК) состоит из 10 мМ ТРУБЫ, 300 Сахароза, 100 мм NaCl, 3 мМ MgCl _2, 1 мМ EGTA. TES буфер состоит из 1% SDS, 2 мМ EDTA, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4.

III. Сотовые фиксации и иммуно-флуоресценции

1. Аккуратно добавить 1 мл 4% формальдегида / PBS каждому покровное и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 минут.
2. Промыть каждую покровное мягко 2-3 раза с 1 мл PBS при 22 ° C.
3. Добавить 400ul 0,1% X-100/PBS Тритон каждому покровное и инкубировать при 22 ° С в течение 10 минут.
4. Промыть каждую покровное мягко 2-3 раза с 1 мл PBS при 22 ° C.
5. Добавить 400ul в размере 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) / PBS и инкубировать при 22 ° С в течение 20 минут, чтобы уменьшить потенциальную окрашивание фона.
6. Промыть каждую покровное мягко 2-3 раза с 1 мл PBS при 22 ° C.
7. Место 100 мкл первичных антител в PBS прямо на покровное и инкубировать при 22 ° С в течение 1 часа. Первичные и вторичные антитела должен быть разведен в ФСБ до необходимой концентрации. Это, возможно, должны быть оптимизированы для каждого антитела используются.
8. Промыть каждую покровное мягко 2-3 раза с 1 мл PBS при 22 ° C.
9. Место 200ul вторичных антител в PBS и инкубировать при 22 ° C вдали от света в течение 1 часа.
10. Промыть каждую покровное мягко 2-3 раза с 1 мл PBS при 22 ° C.
11. Горе каждого покровное (клетки вниз) на предметное стекло микроскопа использованием Vectashield монтажа среде, содержащей DAPI (4 ',6-diamidino-2-фенилиндола гидрохлорид).
12. Протрите избыточного монтажа среды со всего покровное помощью бумажного полотенца и инкубировать слайд при 22 ° С, по крайней мере в 30 минутах езды от света месте.
13. Fix покровное к стеклу с использованием четких лак для ногтей акрилом.
14. Хранить слайды от света до визуализации флуоресцентной микроскопии.

IV. Представитель результаты

Рисунок 2. Субклеточных фракционированием без трансфицированных COS-7 клетках. Фракционированный Cos-7 клетки фиксировали с формальдегидом и immunostained использованием α-тубулина, α-гистонов H1 или α-Ламин / C антител, конъюгированных с TRITC с последующей обработкой монтажа среде, содержащей DAPI . Изображения были получены с 10-кратным линзы глаз и 63x объектив с использованием микроскопа Leica конфокальной. Клеточных ядер были визуализированы с помощью набора фильтров DAPI в то время как в тех же камерах поле окрашивали антителами маркером были визуализированы использованием TRITC набор фильтров.

Рисунок 3. GFP-6Е2 гибридный белок связан с ядерным матриксом. Субклеточных фракционированием Cos-7 клеток, экспрессирующих белок слияния, состоящий из зеленого флуоресцентного белка (GFP), слитый с вирусом папилломы человека (ВПЧ) 6-го типаЕ2 белок (GFP-6Е2). Клеточных ядер были визуализированы с помощью окрашивания DAPI в то время как локализация GFP-6Е2 в трансфекции клеток непосредственно визуализируются с помощью GFP флуоресценции. Ламин / C визуализировалось использованием α-Ламин / C антител, конъюгированных с TRITC и TRITC набор фильтров. Слияние изображений показывают, что некоторые из GFP-6Е2 белок связан с ядерным матриксом (нижняя правая панель). Изображения были получены, как описано на рисунке 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Общие проблемы и предложения:

Все или большинство из клетки потеряли во время стирки. Во время промывки жидкости должны быть медленно добавляют в сторону 6-луночный планшет избегая покровное. Аналогично жидкостей должны быть удалены путем тщательного наклоняя тарелку и ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Chemical	Sigma-Aldrich	A9647-100G
DNase I	Chemical	Sigma-Aldrich	DN25-1G
poly-L-Lysine	Chemical	Sigma-Aldrich	P-8920
Trypsin	Chemical
EGTA	Chemical	Sigma-Aldrich	E4378-25G
Fomaldehyde	Chemical	VWR	284216N
PIPES	Chemical	Sigma-Aldrich	P-6757
Sucrose	Chemical	Fisher Scientific	S/8600/53
Triton X-100	Chemical	Sigma-Aldrich	T-6876
Mounting Medium with DAPI	Chemical	Vector Laboratories	H-1200
Fugene 6 Transfection Reagent	Chemical	Roche Group	11814443001
Histone H1	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-8030
Lamin A/C	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-20681
Tubulin-α	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-32293