Запись Многоклеточные Поведение в Myxococcus Ксанф Биопленки использованием Покадровый микрокиносъемки

Резюме

Для изучения Myxococcus Ксанф Рой поведение, мы разработали покадровой микрокиносъемки протокол, который может быть изменен для различных анализов. Он использует стандартные условия роста адаптированы для микроскопии и дает воспроизводимые результаты за счет использования недорогих, многоразовые прокладки силикона. Мы использовали этот метод для количественного многоклеточных хемотаксис.

Аннотация

Рой δ-proteobacterium Myxococcus Ксанф содержит миллионы клеток, которые действуют как коллективные, координации движения через серию сигналов для создания сложных, динамических моделей, как ответ на сигналами окружающей среды. Эти модели самоорганизации и возникающих, они не могут быть предсказаны, наблюдая за поведением отдельных клеток. Использование покадровой микрокиносъемки отслеживания анализа, мы выявили различные возникающие картины в M. Ксанф называется хемотаксис, определяется как направленное движение лазают по питательным градиент к ее источника ^1.

Для того, чтобы эффективно характеризуют хемотаксис с помощью покадровой микрокиносъемки, мы разработали пластины высоко модифицируемые комплекса (рис. 1) и построен кластер из 8 микроскопов (рис. 2), каждый из которых способен захватить покадровой видео. Анализ является достаточно строгими, чтобы последовательно репликации количественные данные, и в результате видео позволяют нам наблюдать и отслеживать незначительные изменения в рой поведение. Как только захватили, видео передается анализ / хранения компьютер с достаточным объемом памяти для обработки и хранения тысяч видеороликов. Гибкость этой установки, оказалась полезной для нескольких членов М. Ксанф сообщества.

протокол

Поставки необходимо:

• Klett метр
• Внесите и советы
• 2,5 мл пробирок микроцентрифужных
• Микроцентрифуга
• CTTYE СМИ:
  • 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% дрожжевого экстракта (Difco Laboratories),
  • 10,0 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1,0 мМ KH ₂ PO _4, 8,0 мМ MgSO ₄
• TPM СМИ:
  • 10,0 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1,0 мМ KH ₂ PO _4, 8,0 мМ MgSO ₄
• Агароза
• Водяная баня набор до 55 ° C
• Слайды стекло микроскопа
• Большие покровные стекла
• 2 х 2 см, 0,5-мм силиконовой резиновой прокладкой (Grace Bio-Lab Inc)
• Парафильмом (или маркировки ленты)
• Щипцы
• Малый клипы связующего
• Микро-отбор проб пипеткой (Фишер)
• 100 мкл стекла одноразового наконечника (Фишер)
• Kimwipes

Часть 1: Сотовый подготовка

Начните с создания стерильной среде.

• Чистая рабочее пространство, дон перчатки, и легкие горелки.

1. Начало ночной культуры клеток путем посева в колбу CTTYE бульоном и инкубируют в темноте при 32 ° С при энергичном закрученной.
2. Как только культура достигла плотностью 5 × 10 ^{8 кл} / мл, пипетки 1 мл клеток в 2,5 мл микроцентрифужных трубки.
3. Гранул клетки центрифугированием в течение 2 мин при 16000 мкг (или максимальная скорость).
4. Декантировать и отбросить супернатант.
5. Промыть осадок клеток с 1 мл TPM (соль сбалансированную, питательную, свободных средств массовой информации).
   • повторно приостанавливать и вихревые
6. Re гранул клетки, крутя в течение 2 мин при 16000 мкг (или максимальная скорость).
7. Декантировать и отбросить супернатант.
   
   Важнейшим шагом
   
   
8. Полностью измененный приостановить осадок в 100 мкл среды TPM с помощью комбинации пипетки и вортексе.
   
   ВАЖНО: Этот шаг гарантирует, что Есть нет скопления клеток остается в трубке. Это может занять некоторое время.
9. Установите в сторону клетки при комнатной температуре при подготовке отслеживания пластины теста.

Часть 2: Подготовка агара

1. Подготовка 50 мл и TPM (анализ СМИ) и CTTYE (питательные диск) средства массовой информации.
2. Добавить 0,5 г агарозы, чтобы каждый (агарозном меньше, чем дифракционный агар).
3. Автоклав для стерилизации.
4. После стерилизации, поддерживать средства массовой информации при 55 ° С в инкубаторе (или водяной бане) при строительстве комплексов слежения анализа пластины.

Часть 3: Пищевая Строительство Диск

1. Место стерильным 0,5-мм прокладка силиконовая резина в верхней части пламени стерилизовать микроскопический слайд стекла, образуя небольшой колодец.
2. Внесите ~ 300 мкл 55 ° C CTTYE СМИ / агарозы в яме, создаваемой прокладку на слайд и содержащих питательные диска. CTTYE СМИ / агарозном должны насыпи вверх.
3. Место пламени стерилизовать слайд (без прокладки) поверх CTTYE СМИ / агарозы.
   
   ВАЖНО: На этом слайде должен быть установлен вниз, под углом, чтобы предотвратить пузырей.
4. Как только слайд находится в месте, зажим комплекса вместе с мини-клипы связующего - по одной на каждой стороне.
5. Место обрезается комплекс на 4 ° С и позволяют CTTYE СМИ / агарозы, чтобы установить. Это обычно занимает около 5 мин.

Часть 4: Отслеживание Пробирной Подготовка - Настройка пластины комплексы

Соберите компоненты, подготовить слайд комплексы, места питательных диск, залить TPM СМИ / агарозы, отдельных комплексов и сухой плиты, плита клеток, и собрать отслеживания комплексов анализа пластины.

Соберите пластины сложных компонентов

1. Для каждого комплекса, пламя стерилизовать предметное стекло микроскопа
2. Место автоклавного прокладку на верхнюю часть слайда и отложите в сторону (стерилизованное вверх). Это будет форма нижней части теста.
3. Пламя стерилизации стеклянных покровным стеклом и поместить его на вершину второй слайд микроскопом стекла обернут маркировки ленты (или парафильмом) и отложите в сторону (стерилизованное вверх). Это используется как поддержка слайд держать покровное от трещин. Это будет форма верхней части теста.
4. Пламя стерилизовать 1 / 3 микроскопический слайд стекла и отложите в сторону (стерилизованное вверх). Эта информация будет использоваться для выравнивания агарозы.
   
   ВАЖНО: Убедитесь, что форма прокладок печать со стеклом, нажав ее вниз щипцами, в противном случае СМИ / агарозы, могут засохнуть.

P кружева питательных диск

ВАЖНО: Шаги с 5 по 10 должно быть сделано для одного слайда комплекса на время, в противном случае СМИ / агарозы может начаться укрепить приводит к снижению качества фильма.

5. Удалить питательных диска сложная форма 4 ° С (шаг 5 из п. 3) и подглядывать друг от друга слайды подвергая теперь затвердевших CTTYE / агарозы.
6. Удалить диаметром 1 мм 'питательных диск "от CTTYE СМИ / агарозном хорошо описано выше, с использованием микро-отбор проб пипеткой с 100 мкл стекла одноразового наконечника и поместить его в яме, создаваемой прокладку на крышку скольжения (шаг 3) .

Налейте пластин

Важнейшим шагом

7. Внесите ~ 300 мкл 55 ° C TPM СМИ / агарозы в яме, создаваемой прокладку на крышку и скольжения содержащих питательные диска. TPM СМИ / агарозном должны насыпи вверх.
   
   Важнейшим шагом
8. Место пламени стерилизовать слайд без каких-либо прокладку (с шага 3) в верхней части TPM СМИ / агарозы.
   
   ВАЖНО: На этом слайде должен быть установлен вниз, под углом, чтобы предотвратить пузырей.
   
   
9. Как только слайд (с шагом 5) находится в месте, зажим комплекса вместе с мини-клипы связующего - по одной на каждой стороне.
10. Место обрезается комплекс на 4 ° С и позволяют СМИ / агарозы, чтобы установить. Это обычно занимает около 5 мин.

Отдельный и сухие пластины

ВАЖНО: Для предотвращения массовой информации / агарозном от высыхания, шаги с 11 по 20 должны быть выполнены только на один слайд комплекса на время.

ВАЖНО: Для достижения наилучших результатов шаги с 11 по 13 должны быть выполнены при 4 ° C.

11. Как только средства массовой информации / агарозном установил, снимите зажимы и отжать конце комплекса, чтобы ослабить ленту завернутый слайда.
12. Удалите ленту пленку слайдов и поместите его на скамейку для дальнейшего использования.
    
    Важнейшим шагом
13. Использование щипцов, как клин, отдельных скольжения покрова / прокладка / СМИ / агарозном комплекса с поддержкой слайд (без прокладки) и отбросить поддержку слайд.
    
    ВАЖНО: Не используйте любопытных движение отдельных скольжения покрова / прокладка комплекса. Это может привести к разрыву покровным стеклом и / или средств массовой информации / агарозном придерживаться поддержка слайд.
14. Место скольжения покрова / прокладка / СМИ / агарозном комплекса на ленту-завернутые слайд (прокладка стороной вверх) и удалить от 4 ° C. Поместите этот комплекс рядом с горелкой, чтобы все видимые влага испаряется с вновь подвергаются СМИ / агарозном поверхности - не более 1 мин.
    
    ВАЖНО: Не позволяйте СМИ / агарозном сухой слишком долго, поскольку это может повлиять на М. Ксанф рой поведение.

Пластина клетки

Важнейшим шагом

1. Как только лишняя влага испарилась, пипетки 0,5 мкл концентрированной ячейки (шаг 8 из п. 1) на средства массовой информации / агарозном примерно на 1 мм от питательных диска.
   
   ВАЖНО: Это чрезвычайно важно, чтобы убедиться, что клетки на хранение, перемещая пипетку вертикально вниз, а затем прямо вверх. Это гарантирует, что рой будет круговой.
   
   ВАЖНО: Очень важно не трогать пипетки, чтобы средства массовой информации / агарозы. Это сделает депрессии на поверхности и изменить поведение М. Ксанф рой.
   
   Совет: Нажмите пипетки, прежде чем обратиться СМИ / агарозы. Это позволит капли клетки появляются на нижней части кончика пипетки и облегчает хранение клеток.
2. Как только клетки на хранение, место комплексе рядом с горелкой, чтобы клетка место для сухой - не более 20 сек.

Соберите анализа

1. Как только клетка пятно высохнет, выровнять слайд / прокладка комплекса (с шагом 1) с прокладкой на обложке скольжения / прокладка / СМИ / агарозном / клеточный комплекс (с шагом 13) и слегка нажмите вместе, чтобы сформировать печать.
   
   Важнейшим шагом
2. Очистите поверхности скольжения и покровным стеклом с Kimwipe, чтобы удалить остаток оставленные парафильмом. Завершен анализ должен напомнить Рис 1.
3. Место завершена слайд комплекса на нагревательный столик поддерживается на уровне 32 ° C (сползают вниз, накройте ошибиться) сразу же после протереть (шаг 15) для предотвращения образования конденсата форма формирования. Если него образовался конденсат, не говоря слайд комплекса сидеть на нагревательный столик на несколько секунд, прежде чем начать программного обеспечения получения изображений.
4. Выберите подходящую цель (2X, 4X, или 10X).

Часть 5: Кино подготовка

т "> важнейшим шагом

1. Включите камеру и микроскоп, и проверьте уровень освещенности (убедитесь, что свет не слишком интенсивным). Запустите компьютер и открыть программу захвата изображений.
2. Нажмите жить окне изображения и фокуса микроскопа. Изображение должно выглядеть примерно одна показано на рисунке 3. Обратите внимание на однородной поверхности агара.
3. Начало получения изображения.
   
   Важнейшим шагом
4. Проверьте фокусировку регулярно в течение первого часа, как средства массовой информации / агар стремится урегулировать вызывающие фокус в дрейф.
5. Чистая рабочей зоны.
6. После получения изображения завершения, передавать полученные изображения для хранения и сломать слайд комплекса путем замачивания в 90% этанола в одночасье.
7. Автоклав прокладки для повторного использования.

Рисунок 1. Мультфильм иллюстрация комплекс пластины TM. () Показывает основные пластины ТМ комплекса в разобранном виде и поперечном сечении. (B) показывает, использование больших прокладок.

Рисунок 2. Микроскоп кластера. Каждый узел микроскопа (вставка) состоит из микроскопа Nikon E400, задачи, нагревается этапе Insight камеры и ноутбука. Каждый узел объединены в сеть и связаны с компьютера главного контроллера. Два узла настроены с флуоресцентными возможности, которые состоят из источника света и EXFO две створки Uniblitz.

Рисунок 3. 20X образ отслеживания анализа аппарата в момент = 0. Шкала бар, 1 мм.

Рисунок 4. Адаптивность комплекс пластины TM. (А) 100X образ М. Ксанф скользящей подвижности на CTTYE в 1,0% агара. (Б) 20-кратный образ П. палочки подергивания подвижности. (C) 20-кратный образ С. marcescens роятся подвижности. И (B) и (С) были проанализированы на LB в 1,0% агара. (D) 40X образ М. smegmatis скользящей подвижности на LB в 0,5% агара. Этот образ был взят в плен использованием альтернативной конфигурации анализа видно 1B рис.

Видео 1. Покадровой видео рой подвергаются отслеживания анализа.

Видео 2. Покадровой видео M. Ксанф рой, где 1% от клетки флуоресцентно маркированы. Переменный фазового контраста и флуоресцентные изображения были взяты в плен и обложил выяснить положение флуоресцентных клеток внутри роя. Это видео было захвачено на CTTYE в 1,0% агара.

Видео 3. Покадровой видео M. Ксанф скользящей подвижности. Это видео было захвачено на CTTYE в 1,0% агара.

Видео 4. Покадровой видео П. палочки подергивания подвижности. Это видео было захвачено на LB в 1,0% агара.

Видео 5. Покадровой видео С. marcescens роятся подвижности. Это видео было захвачено на LB в 1,0% агара.

Видео 6. Покадровой видео M. smegmatis скользящей подвижности. Это видео было захвачено на LB в 0,5% агара использованием альтернативной конфигурации анализа видно 1B рис.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Покадровый микрокиносъемки (TM) стала стандартным подходом к изучению прокариотических подвижность ^2-7. Традиционно, ТМ выполняется с помощью фильтра фитили бумага, тонкая колодки агар или агар плит в качестве подложек ^8-11. Эти методы являются адекватными и экономически эффе?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0% Casitone	Difco Laboratories
0.5% yeast extract	Difco Laboratories
Micro-sampling pipette	Fisher Scientific
100 μl glass disposable tip	Fisher Scientific
2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket	Grace Bio-Lab Inc.