Тонкие черепа Window Техника для Хронический Двухфотонное В естественных условиях Визуализация мышей микроглии в моделях Neuroinflammation

Резюме

Мы опишем метод неоднократно визуализации мышиной микроглии и циркулирующие моноциты В естественных условиях В течение часов, дней или недель, используя транскраниальная двухфотонной микроскопии. Мы демонстрируем, как готовить в разреженных черепа окно, в котором прерывистого наблюдения покоя микроглии, которые могут быть активированы смежных инъекции стереотаксической от ВИЧ-1 регуляторный белок Tat.

Аннотация

Традиционно в области неврологии, в естественных условиях двухфотонного изображений мышиной центральной нервной системы или связаны с использованием открытого черепа ^1,2 или разбавленной-череп ^{3 препарата.} Хотя открытого черепа техника является очень гибким, оно не является оптимальным для изучения микроглии, потому что это инвазивный и может привести к активации микроглии. Хотя в разреженных черепа подход минимально инвазивных, повторяется заново истончение черепа, необходимых для хронических изображений увеличивает риск повреждения тканей и активации микроглии и позволяет ограниченное число изображений сессий. Здесь мы представляем хронических тонкие черепа окна метод мониторинга мышиной микроглии в естественных условиях в течение длительного периода времени с помощью двух-фотонного микроскопа. Мы демонстрируем, как подготовить стабильной, доступной, в разреженных черепа корковых окна (TSCW) с соединенный стекло покровное, что остается полупрозрачной в течение трех недель периодического наблюдения. Этот препарат TSCW гораздо более иммунологически инертен по отношению к активации микроглии, чем открытые краниотомии или повторные черепа прореживания и позволяет произвольным количеством изображений сессий в течение периода времени недель. Мы готовим TSCW в CX ₃ CR ₁ GFP / + мышей ⁴ визуализировать микроглии с повышенной зеленый флуоресцентный белок до ≤ 150 мкм под мягкой мозговой оболочки поверхности. Мы также показываем, что этот препарат может быть использован в сочетании с стереотаксической инъекции мозг ВИЧ-1 нейротоксическое белок Tat, прилегающих к TSCW, который способен вызывать прочный microgliosis. Поэтому этот метод является чрезвычайно полезным для изучения изменений в микроглии морфологии и подвижности с течением времени в живой мозг в моделях ВИЧ-ассоциированного Нейрокогнитивная расстройство (РУК) и других нейродегенеративных заболеваний с neuroinflammatory компонента.

протокол

1. Подготовка животных для работы с изображениями

1. В наших экспериментах мы используем взрослых CX ₃ CR ₁ GFP / + мышей, которые выражают GFP в мононуклеарных клеточных поколений, в том числе микроглии. ⁴ различных линий мышей могут быть использованы для удовлетворения потребностей конкретного проекта.
2. Анестезию мыши при введении препарата в три препарата коктейль, состоящий из 0,05 мг / кг фентанила, 5,0 мг / кг Мидазолам и 0,5 мг / кг Medetomidine ^5. Хирургическая подготовка к TSCW начинается после животное больше не реагирует на болевые стимулы, такие, как хвост крайнем случае. На протяжении хирургии и обработки изображений, мы держим животных на грелку, чтобы предотвратить после анестезии гипотермии. Если необходимо, бустерной дозы одной трети оригинального дозу анестетика коктейль может быть дано для восстановления первоначальной плоскости анестезии.
3. Обложка глаза животного с защитной мазью глазной сохранить глаза влажными во время анестезии, которая подавляет закрытием век животного. Удаление волос с головы животного использования бритвы, ножницы, ножницы, или химическими методами. Лечить кожи головы с использованием 10% повидон-раствор йода и 70% этанола. Все хирургические инструменты должны быть в автоклаве, стерилизуют стеклянные бусины-стерилизатор или дезинфицируют 70% этанола.
4. Сделать средней линии разрез кожи головы с помощью небольших ножниц, начиная с 4-5 мм каудально по отношению к черепу и продвижения вперед к передней части глаза. Важно, что этот разрез быть достаточно длинными, чтобы кожа не будет вмешиваться в склеивании голове пластина, которая используется для стабилизации мыши голове в течение двух-фотонного томографии (рис. 1). Определить области, чтобы разбавлять при вскрытии области. Избегайте областей, представляющих интерес непосредственно расположенных над черепных швов, как череп менее стабильна в этих областях и основных крупных сосудов и мозговых оболочек будут мешать визуализации.
5. Применять 100% этанолом, затем 10%-ным раствором хлорного железа с стерильный ватный тампон, чтобы высушить мембраны в верхней части черепа и очистить их прочь с использованием тонких пинцетом или лезвием бритвы. Ошибка удаления мембраны приводит к неустойчивой привязанности пластины голову.
6. Место тонкий слой клея Permabond 910 по краям окна просмотра под голову тарелку. Место голове пластина покрыта клеем по площади процентов на череп животного с легким нажимом (рис. 1). Важно, чтобы голова пластина только приклеены к кости черепа. Любой кожи или мембран, которые находятся между пластиной голову и череп будет уменьшаться стабильность связи. Нанесите небольшое количество акрилатных вокруг окна просмотра с помощью шприца мгновенно связь клея. Наконец, нанесите небольшое количество Loctite 454 до краев смотровое окно для предотвращения утечек.
7. Винт головой пластину животных держатель (рис. 1) и проверить стабильность голову пластины под рассечение объем, слегка зондирования с парой щипцов. Там должно быть никакого движения черепа по отношению к голове тарелку. Место падения физиологического раствора на окно просмотра для обеспечения Есть нет утечки.

2. Подготовка тоньше черепа Корковая Window

1. В ходе подготовки к истончение череп, сухие черепа, используя комбинацию стерильные ватные тампоны и сжатого воздуха. Мы изначально тонкий череп с стерильных IRF 007 сверло в дрель Microtorque II установлена ​​на уровне 4000 оборотов в минуту. Очень нежно, начинайте прореживание 2-2,5 мм в диаметре круговой области черепа. Используйте только легкие размашистые движения почти параллельно черепу; использовать не прямой понижательное давление. Стоп бурения каждые 20-30 секунд, чтобы удалить пыль при помощи костного сжатого воздуха. Эти перерывы в бурении позволяют черепа для охлаждения, так что нет тепла вызванного повреждения основной ткани мозга.
   1. Как бурения прогрессирует, обратите внимание, переход к влажным губчатый слой кости (т.е. "диплоэ"). Как только этот слой будет достигнута, упражнения дополнительное предостережение с дрелью.
2. Время от времени проверять тонкость черепа путем размещения солевой более разбавленной области и просмотра под рассекает области. Соленая в дальнейшем позволяют рассеивания тепла. Как череп поредели, меньше сосудистой становится видимым.
3. Использование стерильного стоматологического MicroBlade для достижения окончательного прореживания в условиях засоления, а MicroBlade предоставляет намного больше тактильной обратной связи по поводу стабильности черепа. Это позволяет гораздо тоньше, чем при подготовке сверлить в одиночку. По нашему опыту, оптимальная толщина черепа составляет 10-30 мкм.
   1. Важно проверить тонкость череп под epifluorescence несколько раз в течение первых нескольких попыток на то, чтобы тонким окном черепа. Резкость и глубину видимых микроглии и сосудистую дают хорошее представление о том, когда окно готово для работы с изображениями.
4. Как только окно будет готово, клей на заказ прямоугольный кусок # 0 ш покровного стекла м размером менее 2 мм с каждой стороны за окном. Использование диаметром 1,0 мм стеклянную пипетку, поместите небольшую каплю клея на цианоакрилат разбавленной череп области и осторожно опустите вниз небольшой кусочек покровное, то слегка нажмите на черепе, чтобы отжать избыточное количество клея. Важно, чтобы избежать образования пузырьков между стеклом и клеем с захваченного воздуха приведет к области под стать оптически непрозрачных. Цианоакрилат клей используется, поскольку она остается прозрачным после высыхания, а также предотвращает кость и мембранные отрастания сохранность черепа под окном тонким и прозрачным. Если есть какие-либо клея на верхней части крышки стекла, использование MicroBlade осторожно удалите его один раз покровного стекла на месте и клей высохнет.
5. Анальгетик (например, бупренорфин 2 мг / кг подкожно) вводят сразу после операции и вновь вводят в каких-либо признаков боли, в том числе нежелание двигаться, есть, ни пить, потеря веса, слюнотечение, пилоэрекции, дыхательных звуков, и т.д.

3. Двухфотонное изображений

1. В ходе подготовки к двухфотонного изображения, покрывают TSCW физиологическим раствором и найти сферу интересов под epifluorescence (рис. 2). Для того чтобы последующие визуализации области, принимать изображения с помощью фотокамеры.
2. В течение двух-фотонной обработки изображений, мы используем на заказ двухфотонного микроскопа ⁶ с титан-сапфирового лазера, настроенного на 920 нм. Флуоресценции обнаружена с помощью ФЭУ в целом поля режиме обнаружения и 580/180 выбросов фильтр. 20X воды погружения линз (0,95 NA) используется в визуализации сессии. Максимальный выходной мощности лазера на цель находится между 50 и 65 мВт.
3. Выберите область интересов в корковых слоях я или II (до 150 мкм ниже пиальных поверхности). Для облегчения повторной обработки изображений, снимать же поле зрения скоростью 1x, 2x, а также 3-кратным цифровым зумом. Кровеносные сосуды могут служить в качестве ориентиров, чтобы легко найти то же самое поле зрения в течение последующих сессий визуализации. Под зум 3x, несколько Z-стеки с 80-90 Z-шаги в каждом стеке и 0,69 мкм шаг может быть приобретено через каждые 5 минут до 30 минут, что позволяет хорошая выборка микроглии морфологии и поведения с течением времени ( Рисунок 3). Между приобретения Z-стеки, следует проверить уровень физиологического раствора в течение TSCW, а также глубина животного анестезии.

4. Инъекция ВИЧ-1 Нейротоксин, Тат

1. Во-первых, silanize внутренней оболочки иглой 35 и 10 мкл шприц микрообъеме для предотвращения Тат осаждения. Вывод silanizing решение (Sigmacote), пока она заполняет обе иглы и шприца. Разрешить решение, чтобы сидеть в течение 5 минут при комнатной температуре. Пустые решение от шприц, снимите поршень, и позволяют шприца и иглы до полного высыхания. Наконец, промойте шприц и иглу тщательно деионизированной водой.
2. Выполните небольшое краниотомии диаметром 0,5 мм или 3 мм ростральной или сбоку от TSCW где двухфотонного изображения были получены с использованием меньшего сверло и тщательно истончение черепа, пока пара щипцов с острыми наконечниками можете удалить слой разбавленной кости от легко. Мы используем 10 мкл шприц микрообъеме оснащен 35 иглы контролируется шприц Ultramicropump III насос, установленный на 3-х осевой микроманипулятора и после выстраиваются иглы для трепанации черепа, он осторожно подошел к глубине от 700 до 900 мкм ниже пиальных поверхности, где 3 мкл Тат _1-72 (или других провоспалительных агентов) или физиологического раствора (или управление транспортным средством) поставляется в 80 л / мин.

5. Содержание животных

1. Если животное для включения в образ несколько раз в течение одного дня, накрыть крышкой открытой площадке черепа со смесью мази глазной и вазелин для предотвращения дискомфорта или повреждения черепа между изображениями сессий. Отключите поддержку мост от маленькой головой пластины (рис. 1В) и поместить животное в клетку с нагревается легко доступной пищи и воды. Все животные должны быть размещены отдельно после операции в любое время. После визуализации сессий для животных полно тот или иной день, тщательно удалить всю голову пластину и шовный кожу назад на черепе с № 6 или меньше шва. Опять же, дом животных отдельно с легко доступной пищи и воды между экспериментальными дней. Проверьте животных ежедневно в течение каких-либо признаков стресса, боли, или инфекции.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1. Стабилизация животных для хирургии и двухфотонного томография () и глава плиты (B).

Рисунок 2. GFP-меченых микроглии визуализированы с epifluorescence.

jove_content ">
Рисунок 3. GFP-меченых микроглии визуализированы с двухфотонным изображений после имплантации TSCW, около 50 мкм ниже пиальных поверхности. Единый двухфотонного разделов приняты 15-30 минут после имплантации TSCW (день 0), а также 7 и 17 дней спустя, показали, что окна остается ясным пока остается микроглии выведен из эксплуатации в отсутствии воспалительных оскорбления. Z-проекции приняты 6 и 24 часов после инъекции нейротоксина ВИЧ-тат выставка впечатляет морфологические изменения активированной микроглии. Шкала бар: 10 мкм.

Обсуждение

Существует растущий консенсус, что фактический субстрат для ВИЧ-1-ассоциированные нейрокогнитивный дефицит (РУК) является разрушение синаптических архитектуры, предположительно вызванной провоспалительных медиаторов освобожден от инфицированных ВИЧ-1 мононуклеарных фагоцитов. Микроглии активации, многоядерные гигантские клетки, а из-за глиоз астроцитарных гипертрофии считаются неспецифические признаки ВИЧ-1 инфекции и воспаления в центральной нервной системе ^7. В отличие от тяжести заболевания предсмертном периоде неврологические было связано с потерей синаптических сложности, а также макрофагов бремя в ЦНС ^8,9,10,11. Тем не менее, динамическое взаимодействие между микроглии, периферической проникновения макрофагов и нейронов у пациентов с рук просто не могут быть смоделированы с использованием обычных статических обработки полученных из обычных иммуноцитохимического исследований. Последние исследования, проведенные в нашей лаборатории показали, что по крайней мере некоторые из этих взаимодействий между периферической и центральной мононуклеарных клеток и нейронов могут быть смоделированы при частичной стереотаксической инъекции ВИЧ-1 белок Tat _1-72 в паренхимы мозга (Lu, Маркер, Трамбле, Ци, и Гелбард, неопубликованные данные). Поэтому мы решили применить в естественных два изображения фотонов для изучения взаимодействия между моноцитарных макрофаги микроглии мозга резидентом и нейронов, в послушный маленькая модель животного для neuroAIDS. Хотя открытого черепа или в разреженных черепа подготовки позволить себе единый экзамен корковых архитектуры в течение короткого периода времени (часы), следователи заинтересованы в ход времени подострого события не могут использовать эти препараты без artifactually активации микроглии / макрофагов в связи с хирургической манипуляции свода окна. Здесь мы показываем, простой способ обойти это ограничение путем склеивания крошечный кусочек стекла покровного более разбавленной череп области предотвращения свода черепа с регенерирующим в TSCW а также поддержания прозрачности в течение ≥ 3 недель. Кроме того, мы показали, что этот метод позволяет нам контролировать поведение моноцитов в периферической ввода церебрального микроциркуляторного русла, а также мозг-нерезидентов микроглии в ответ на стереотаксической инъекции ВИЧ Тат _1-72 в коре головного мозга мышей гетерозиготных по CX ₃ CR ₁ / GFP ( выявить клетки мононуклеарных линии). Этот метод может быть легко адаптирована для использования на мышах с различными генетическими фона, например, мы обычно используем гетерозиготных CX ₃ CR ₁ / GFP X Thy-1 YFP ¹² мышей для исследования взаимодействий между моноцитарных макрофаги микроглии мозга резидентом и нейронов в в естественных моделей neuroinflammation отношение к руке. Наши TSCW препарата позволяет исследователям для изучения межклеточных взаимодействий между периферией и ЦНС, которые могут возникнуть в течение периода недели, в котором животное может быть повторно отображаемого до и после экспериментального лечения. Таким образом, каждое животное может служить ее собственным контролем. Одно предостережение для этой модели TSCW в том, что клетки-мишени при расследовании должны быть либо генной инженерии, чтобы выразить расширенной флуоресцентных белков (eXFP) или быть помечены флуоресцентным красителем без механических нарушение свода черепа, и что выражение eXFP должен быть достаточно прочным, чтобы позволяют сотовой архитектурой для визуализации изображений после повторных сеансов в течение нескольких недель.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate	Hospira Inc.
Midazolam hydrochloride	Baxter Internationl Inc.
Medetomidine hydrocholoride (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Heating pads	Beyond Bodi Heat
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Povidone-iodine 10% solution	Betadine Puredue Pharma
Ferric chloride 10% solution	Ricca Chemical Company	3120-32
Methyl cyanoacrylate 910	Permabond
Cyanoacrylate 454	Loctite
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Microtorque II handpiece kit	Pearson Assessments	R14-0002
IRF 007 drill bits	Fine Science Tools	19008-07
Norland bendable microblade full radius	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cyanoacrylate	The Original Superglue
#0 glass coverslip	Electron Microscopy Sciences	63750-01
10 μl Microvolume syringe	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
35 gauge NanoFil needle	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Ball Mill, Carbide bits #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Photomultiplier tube	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Ti:Sapphire laser Mai-Tai	Newport Corp.