Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

Резюме

Аннотация

протокол

Реакция обратной транскриптазы

Включите нагревательный блок до 70-80 ° С и 42 ° C. Водяные бани также может быть использован в этом шаге. При использовании нагрева блоков, положить немного воды так, чтобы тепло равномерно.

1. Грунтовка реакции
   1. Принимать 3 мкг РНК
   2. Регулировка громкости до 13 мкл водой РНКазы свободный
   3. Добавить 2,5 мкл случайных гексамера праймеров (2mg/mL)
2. Хорошо перемешать и инкубировать при 70-80 ° С в течение 8 минут. Затем поместите на льду в течение 5 мин.
3. Подготовка РТ коктейль (14,5 мкл / Rxn):
   
   

   Компонент	Объем
   5X первых буфера Strand	6 мкл
   0,1 М ДТТ	3 мкл
   25X aminoallyl-дНТФ смеси	1,2 мкл
   Надстрочный II RT (200U/μl)	2,3 мкл
   Воды	2,0 мкл

   
   * Для реакций п, подготовка Master Mix для п 0,5 порции коктейля, чтобы заверить, что вы не закончатся.
   
   
4. Добавить 14,5 мкл до охлаждения реакций.
5. Mix (не вихря) и инкубировать при 42 ° С в течение 3-4 часов
6. Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.

Гидролиза РНК

1. Для каждого образца, добавляют 3 мкл 1 N NaOH и 0,6 мкл 0,5 М ЭДТА. (Финальный conc.s = 100мм NaOH, 10 мМ ЭДТА)
2. Смешать и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 10 минут.
3. Нейтрализовать добавлением 33,6 мкл 1М HEPES, рН = 7,0 (конечная конц .= 500 мм HEPES)
4. Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.

Реакция очистка: Удаление неинкорпорированных аа-dUTP и свободные амины

Примечание: Это очищение протокол изменяется от PCRpurification Qiagen протокол QIAquick комплект. Мыть фосфата и элюирования буферов заменить Qiagen поставляется буферов потому Qiagen буферы содержат свободные амины, которые конкурируют с реакции сочетания Cy красителя. Столбцы из мини-приготовительные комплект может также использоваться.

1. Смешайте кДНК реакции с 300 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 336 мкл) буфера PB (Qiagen входит в комплект) и трансфер в колонке QIAquick.
2. Место колонки в 2 мл пробирки (Qiagen входит в комплект) и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции.
3. Чтобы промыть, добавить 750 мкл промывочного буфера фосфата (не Qiagen), чтобы колонны и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты.
4. Пустые пробирки и повторить 750 мкл мыть и центрифугирования шаг.
5. Пустые пробирки и центрифуги колонки еще 1 минуту при максимальной скорости.
6. Передача столбец на новое 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера для элюции фосфата. (См. раздел приготовления раствора)
7. Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
8. Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты.
9. Элюировать второй раз (и еще 30 мкл фосфатного буфера элюирования) в ту же трубку, повторив шаги 6-8. Конечный объем элюирования должно быть ~ 60 мкл.
10. Количество кДНК может быть определена количественно на этом этапе:
    нг кДНК = (коэффициент разбавления) (OD260) (37) (общий объем вымывают из колонки)
11. Сухой образец в вакууме скорость при 45 ° C.
12. Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.

Муфта аа-кДНК Су Dye Эстер

1. Ресуспендируют aminoallyl меченные кДНК с 10 мкл 50 мМ Na-бикарбонат, рН = 9,0, если необходимо. (Этот буфер должен быть свежим каждые две недели)
2. Работа в темном месте, добавить зонда трубка соответствующего красителя Су. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендирования красителя.
3. Инкубируйте реакции в течение 1 часа в темном месте при комнатной температуре. (Инкубация может доходить до двух часов)

Реакция Очистка II: Удаление несвязанных красителя

1. К реакционной добавить 35 мкл 100 мМ NaOAc рН 5,2. Тщательно перемешать.
2. Добавить 250 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 225 мкл) буфера PB (Qiagen прилагается) для каждого образца и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
3. Место колонке QIAquick спина в 2 мл пробирки (Qiagen в комплект поставки), применять образец столбца, а центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции.
4. Чтобы промыть, добавить 0,75 мл буфера PE (Qiagen в комплект поставки) к колонне и центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты.
5. Повторите шаг 4.
6. Пустая труба сбора и центрифуги колонку еще на 1 минуту при максимальной скорости.
7. Место колонку в чистую 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера EB (Qiagen в комплект поставки) к центру колонки мембраны.
8. Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
9. Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты.
10. Элюировать второй раз в ту же трубку, повторяяшаги 7-9. Окончательный элюировали объем должен быть ~ 60 мкл.

Анализ маркировки Реакция

Количество кДНК и метка может быть определена количественно на этом этапе:

• Мера 260 OD, 550 и 650 (Бланк является вода.) Используйте nanodrop программы микрочипов.
• Рассчитать пмоль красителей регистрации и пмоль ДНК и пис / красителя отношения с заданными уравнениями ниже:
  
  пмоль нуклеотидов = [OD260 * объем (мкл) * 37 нг / мкл * 1000 пг / нг] / 324,5 пг / пмоль

Примечание: 1 OD260 = 37 нг / мкл для кДНК; 324,5 пг / пмоль средней молекулярной массой дНТФ)
пмоль Cy3 = OD550 * объем (мкл) / 0,15
пмоль Cy5 = OD650 * объем (мкл) / 0,25
нуклеотидов / красителя соотношение = пмоль кДНК / пмоль Су красителя

Если вы используете nanodrop, это уже дает пмоль / мкл для каждого красителя. Вам нужно только умножить это число на объем, чтобы получить общее пмоль включению красителя.

Обратите внимание:> 150-200 пмоль красителя включения в образец и отношение менее 20 нуклеотидов / молекул красителя является оптимальным для гибридизации.

• Образцы могут храниться при температуре -20 ° С в темноте.
  • Комбинат зонды для гибридизированных вместе и сухой вниз в speedvac на 42 ° C.
  • Образцы могут храниться при температуре -20 ° С до готовности Hyb.

Предварительно Hyb слайдов

1. Лицо Место сползают вниз по РТ 100 мл воды в чистую красный держатель слайдов в течение 3-5 минут
2. Привязка сухой слайд, поставив лицом вверх на 100 ° Блок отопления С в течение нескольких секунд - следите за конденсации исчезают
3. УФ перекрестные ссылки слайд при 250 mJoules (Введите 2500 до УФ сшивателя)
4. Гидратов слайды, опуская в предварительно разогретой воды 42 ° C. Спиновые 5 мин при 700 RPM при комнатной температуре.
5. Инкубируйте слайдов в 50 мл банку Коплин содержащие подогретого предварительно Hyb (5XSSC, 1% БСА, 0,1% SDS) не менее 45 минут при 42 ° С, а инкубационный может идти дольше, если это необходимо.
   
   50 мл предварительно Hyb буфера: 12,5 мл 20х SSC, 10 мл 5% БСА, 0,5 мл 10% SDS, 27 мл воды
   
   
6. Dip слайдов в подогретого воде (42 ° С) и агитировать за пару минут, чтобы удалить предварительно Hyb буфера.
7. Полоскание в изопропанола и спина 5 мин при 700 оборотах в минуту, комнатной температуры, чтобы высохнуть.

Подготовка образцов для гибридизации

1. Ресуспендируют зонд в воде (объемы приведены ниже)
   
   

   Для общего об. = 30μl	Для общего об. = 35μl	Для полной том .= 40μl
   19,8 мкл воды	23,55 мкл воды	27,2 мкл воды
   1,5 мкл	1,5 мкл	1,5 мкл	10 мг / мл ДНК спермы лосося (Invitrogen)
   1,2 мкл	1,2 мкл	1,2 мкл	12,5 мг / мл тРНК
   4,5 мкл	5,25 мкл	6 мкл	20XSSC (3X окончательный)
   3 мкл	3,5 мкл	4 мкл	1% SDS

   
   Примечание: порядок добавления реагентов важны. Не готовьте мастера микса.
   
   
2. Кипятить 5 минут, затем спина 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Прохладный в течение 2 мин при комнатной температуре.

Гибридизация

1. Добавить 10-12 мкл 3Х SSC для скважин гибридизации камеры на каждом краю и в центре.
2. Добавить чистой скольжения ручка для соответствующей области слайда и аккуратно нагрузки в гибридизации решения (30 -40 мкл). Там должно быть очень образца на обеих боковых покровным стеклом.
3. Место слайда в камере. Затяните винты и места в 65 ° С водяной бане в течение ночи. Не устанавливайте камеру непосредственно на дно ванны. Место блока в верхней части верхней камере провести все на месте. Держите крышкой на водяной бане для защиты светочувствительных образцов.

Hyb Моет

1. Подготовьте следующие буферов:
   • 1X SSC, 0,05% SDS
   • 0,06 X SSC
2. После инкубации распечатать камеру гибридизации. Удалить слайд из камеры, следя за тем, чтобы не нарушить покровное.
3. Для удаления покровные, погрузи слайдов в блюдо с теплой 1X SSC, 0,05% SDS промывочный буфер покровное направлен к нижней части блюда. Покровное будет падать, перемещая слайд стороны в сторону.
4. После покровное удаляется, место слайда в стойку свежие ванну с теплой 1XSSCm 0,05% SDS. Агитировать за пару минут
5. Передача слайдами плюс стойки для ванны 0,06 X SSC.
6. Передача слайдов на другой бам на 0,06 X SSC содержащие свежие стойку, промокательной слайд на бумажное полотенце, чтобы удалить как можно больше SDS-содержащих буфера возможно прежде, чем поместить на свежем ванну.
7. Перемешивают слайды в течение нескольких минут.
8. Спиновые сразу при комнатной температуре в течение 5 мин при 700 оборотах в минуту, то слайды готов к сканированию. Хранить в темноте, пока проверяются.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.