IP-FCM: Иммунопреципитация обнаружен с помощью проточной цитометрии

Резюме

IP-ТСМ метод представляется, что позволяет чувствительный, надежный, биохимическая оценка родной белок-белковых взаимодействий, не требуя генной инженерии или больших размеров образца.

Аннотация

Иммунопреципитация обнаружены с помощью проточной цитометрии (IP-ТСМ) является эффективным методом для выявления и количественной оценки белок-белковых взаимодействий. Основной принцип распространяется, что сэндвич-ИФА, в котором захватили первичной аналита может быть обнаружена вместе с другими молекулами физически связаны в multiprotein комплексов. Процедура включает ковалентные связи микрошарики полистирола латекса с immunoprecipitating моноклональных антител (МКА), специфичные для белок, инкубации эти бусы с клеточные лизаты, исследуя захваченные белковые комплексы с флуорохромом сопряженных зондов, а также анализ шарик связанных флуоресценции с помощью проточной цитометрии. IP-ТСМ чрезвычайно чувствительна, позволяет анализа белков на родном (не денатурированного) состоянии, и может принять или полуколичественного или количественного анализа. В качестве дополнительных преимуществ, IP-ТСМ не требует генной инженерии или специализированного оборудования, кроме потока цитометр, и она может быть легко адаптирован для высокопроизводительных приложений.

протокол

** Это видео протокол основан на связанный публикации ^1: Высокая чувствительность обнаружения и количественного анализа родной белок-белковых взаимодействий и multiprotein комплексов с помощью проточной цитометрии. Адам Г. Шрум, Диана Гиль, Элейн П. Dopfer, Дэвид Л. Вист, Лоуренс А. Турка, Вольфганг WA Schamel, Эд Палмер. STKE Науки 2007 (389): pl2, 5 июня 2007 года [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть эту публикацию .

До начала приготовьте После водных растворов складе:

МЧС муфты буфера:	Хранить при температуре 25 ° C
MES, рН 6,0	50 мМ
ЭДТА	1 мМ
Закалка / Блокировка / Storage (QBS) Буфер:	Хранить при температуре 4 ° С
BSA	1%
Азид натрия	0,02%
PBS, рН 7,4	1x
ТСМ буфера:	Хранить при температуре 4 ° С
Трис, рН 7,4	50 мМ
NaCl	100 мМ
Азид натрия	0,02%
FBS	5%
PBS, рН 7,4	1x

Подготовка непосредственно перед использованием:

EDAC-MES:	Растворите 50 мг / мл порошка EDAC в буфере MES муфта
Дигитонин решение (2% м / о):	Растворите порошок в дигитонин дН 2 O при нагревании до 95 ° С в течение 5 минут, то охлаждение на льду
Лизис буфера:
Трис, рН 7,4	50 мМ
NaCl	150 мм
Дигитонин решение	1%
Ингибиторы протеазы	1x
Держите на льду

1. Взаимодействие МКА с бисером

1. Определить концентрацию бусы из приобрела акции путем разведения в PBS и подсчета с hemacytometer. Начните с 1:10000 разбавления шарики для подсчета голосов.
2. Внесите 18 х 10 ⁶ бусин в 1,5-мл микроцентрифужных трубки.
3. Вымойте бисером 2 до 3 раз в 0,5 до 1,0 мл буфера Муфта МЧС, центрифугированием при 20000 г в течение 3 минут при 25 ° С после каждого мытья.
4. Ресуспендируют бусины в 50 мкл буфера Муфта МЧС.
5. Активировать карбоксильных групп на бисер, добавляя 20 мкл свежеприготовленного EDAC-MES.
6. Осторожно смешивать в течение 15 мин при 25 ° С, вручную пипетирования вверх и вниз.
7. Вымойте активированный бисером 2 до 3 раз в 0,5 до 1,0 мл PBS, центрифугированием при 20000 г в течение 3 минут при 25 ° С после каждого мытья.
8. Ресуспендируют активированный бусины в 50 мкл PBS.
9. Добавить 50 мкл IP МАБ (на 0,2-1,0 мг / мл фондовом концентрации), чтобы активировать бусинка решение.
10. Смесь для 3 до 4 часов при 25 ° С, поставив трубку на вибрирующий шейкер. Встряхните достаточно, чтобы предотвратить заселение бусины на дне пробирки.
11. Вымойте мАт связью бисером 2 до 3 раз в 0,5 до 1,0 мл PBS, центрифугированием при 20000 г в течение 3 минут при 25 ° С после каждого мытья.
12. Ресуспендируют бисером в 100 мкл буфера QBS. Их можно хранить при температуре 4 ° C.
13. Приостановка бусины хорошо, развести 1:200-1:10,000 в ФБР и считаться с hemacytometer. Концентрация должна быть измерена для каждой партии препаративных, так что количество бусинок, используемых в каждом эксперименте IP или выпадающее можно точно контролировать.

2. После ядерных Подготовка лизат и Ip

Метод лизиса и оптимальные условия лизиса будет зависеть от типа клеток и белок-белковых взаимодействий изучается. Количество протоколов существуют и могут быть изменены для вашего приложения.

1. Lyse 20 х 10 ⁶ «малых» клеток, таких как лимфоциты, или 5 х 10 ⁶ "больших" клетки, такие как макрофаги или опухолевые клетки, в 100 мкл буфера свежие Лизис в 1,5-мл микроцентрифужных трубка для 20 минут на льду. Шкала лизис объем по мере необходимости.
2. Для удаления ядер и нерастворимые продукты распада клеток, центрифуги лизат в 20000 г в течение 10 мин при 4 ° C. Держите супернатант и отбросить гранул.
3. Добавить 0,5 х 10 ⁵ до 2,5 х 10 ⁵ мАт связью бисером, чтобы уточнить лизат, пипетки осторожно перемешать. Минимальный объем мы используем длявыполнение одного IP в 5 мкл.
4. Место на вертикальное колесо вращающихся 4 часа, чтобы на ночь в холодной комнате. Установите в достаточной скоростью, чтобы предотвратить бусы из поселения. Это приемлемо для жидкости с низким объемом IP-адресов, чтобы оставаться в нижней части трубки во время вращения.

3. Зондирование бисера плену белка с флуорохромами конъюгированных антител

1. Вымойте IP бисером два раза в 0,2 до 1,0 мл ледяной буфера FCM, центрифугированием при 20000 г при 4 ° С в течение 3 минут после каждого мытья.
2. Ресуспендируют бисером в 100 мкл буфера FCM и аликвоту 20 мкл в каждую из пяти или более 1,5 мл микроцентрифужных труб или скважин каминной нижней пластине.
3. Добавить флуорохромом сопряженных моноклональных антител к образцам. Выполните ТСМ пятно в соответствии с инструкциями производителя или в соответствии с эмпирически определяется концентрацией. В качестве отправной точки, добавить 0,2 до 1 мкл исходного раствора антител (на 0,2-1,0 мг / мл) в трубе или хорошо, и инкубировать в течение 40 мин на льду.
4. Вымойте исследовали бусины 1,5-мл пробирки два раза в 1,0 мл ледяной ТСМ буфера, центрифугированием при 20000 г при 4 ° С в течение 3 минут после каждого мытья. Аккуратно удалите супернатант после каждого мытья, следя за тем, чтобы не нарушить бисером. Для каминной нижнюю пластину, вымыть два раза с 0,2 мл ледяной буфера FCM, центрифугирования при 1000g в течение 5 мин при 4 ° С, после каждого мытья. Многоканальная пипетка полезно для этого шага. Чтобы удалить супернатант из бисера в каминной нижнюю пластину, 'фильм' пластины один раз, затем, в то же время вверх-вниз, промокните любые капли от краев скважинах. Остаточный объем в каждую лунку, содержащую бусы, будет около 20 мкл.
5. Ресуспендируют бисером в 200 мкл буфера FCM на образец. Трансфер помечены FACS труб. Образцы уже сейчас готовы к FCM.

4. Приобретение ТСМ

CML бисером, описанных в данном протоколе от 3 до 5 мкм в диаметре, примерно половина диаметра покоя лимфоцитов мыши. В связи с этим может возникнуть необходимость вручную увеличить Forward Scatter (FSC), коэффициента усиления и боковое рассеяние (SSC) напряжение для того, чтобы население событий бусинка зарегистрироваться на масштабе. Индивидуальные IP бусин должны составлять единый плотно кластерных населения. Настройки и ворота должны быть скорректированы, чтобы исключить бусинка дублетов и мусора.

1. Перед запуском бусы или бисер стандартов, удалить рукав капли сдерживания, которая окружает образца входе на некоторые цитометрах. Разрешить оболочку жидкость капать между образцами, так как это будет ясно входе и предотвращения бусы из проводятся от одного образца к другому.
2. Используйте немеченого бусы, отрицательный контроль флуоресценции, и радуга Калибровка Частицы (СКТ), положительный контроль флуоресценции, чтобы изменить параметры так, чтобы оба отрицательные и положительные флуоресценции крайности появляться одновременно на логарифмической шкале оси абсцисс. Это гарантирует, что флуоресценция из экспериментальных образцов также будет на уровне. Обратите внимание, что СКТ меньше бисером ХМЛ, так FSC и SSC параметров, а также ворота положение, возможно, должны быть временно изменена для этого образца.
3. Вернуться в немеченого-бусинка настройки один раз калибровка с СКТ является полным. Если только один флуоресцентного зонда на образец используется, не флуоресценции компенсации является необходимым. В общем, мы зонд multiprotein комплексы с одной флуорохромом сопряженных МКА по образцу ТСМ, и мы рассмотрим несколько партнеров взаимодействия окрашиванием параллельно бусинка образцов с моноклональных антител, специфичных для различных подразделений.
4. Приобретение и сохранение флуоресценции файлов данных. Анализ может быть проведен с использованием проточной цитометрии программы, такие как CellQuest, FlowJo или Cflow.

5. Представитель Результаты

Рисунок 1. IP-ТСМ для TCR/CD3 multiprotein комплекса. Т-клеток от мышей штамма BALB / с лизировали в 1% дигитонин и лизат подвергали IP-ТСМ с использованием анти-CD3ε бисером. Захватили комплексы содержали значительные количества TCR-β (фиолетовая область) и совместное связанные CD3-ε (зеленый), но близких к фоновым уровням (определяется не имеет значения зонд иммуноглобулина, розовый след) других белков, таких как Thy1.2, CD45, или Н-2К (г) (коричневый, оранжевый и синий следы, соответственно). Смотрите аналогичные ранее опубликованные результаты ^1-6.

Обсуждение

Информация о белок-белковых взаимодействий является весьма актуальным для анализа многих клеточных процессах, таких как передача сигнала, линии созревания, клеточного цикла прогрессии, и апоптоза каскадов. IP-ТСМ обеспечивает быстрый, количественные и чувствительным способом для изучения взаимодействия белков и определять члены multiprotein комплексов в их нативной конформации. Бусины могут быть связаны и инкубировали с клеточных лизатов в один день и могут быть проверены и проанализированы на следующий день. 96-луночный планшет формата позволяет большое количество образцов для анализа в свое время для обеспечения эффективного сбора данных для статистических целей или скрининг. Использование флуоресцентного шарик стандартам, количество белков, захваченных каждый шарик может быть оценена. Очень мало исходный материал необходим для захвата и обнаружения, поэтому небольших образцов и дефицитных аналитов все еще может быть проанализирован для различных взаимодействий. Хотя IP-ТСМ не требует генной инженерии, эпитопа-тегов, денатурация, или в пробирке смешивания белков в нефизиологических окружающей среды, он может быть связан с этими и другими методами, что делает его ценным и доступный инструмент с применимость к многих биологических системах.

Устранение неполадок:

Многие IP-ТСМ экспериментов генерировать полезные данные взаимодействия белка в первый раз они пытались. Тем не менее, оптимизации IP-ТСМ может улучшить антител конъюгации с бисером, белкового комплекса захвата и флуоресцентного зонда обязательными.

Эффективность ИС сопряжения антител можно определить с помощью зондирования связаны непосредственно с бисером против иммуноглобулинов антител. Если эта эффективность низка, повышение концентрации антител в реакции сочетания может позволить более IP-антител приложить к каждой бусинке. Это может увеличить связывающей способности IP-бусинка партии, что приводит к усилению захвата и обнаружения аналитов. Другие первичные-амин, содержащий молекулы (например Трис, бычий сывороточный альбумин), не должны присутствовать во время реакции сочетания, так как они могут конкурировать с МКА для бортовых привязанности и приводить к снижению связи МАБ. Если сопряжение МАБ для бусин оказывается проблематичным в силу других причин, бусы может вместо быть связаны с авидин / стрептавидином и биотинилированного антитела могут быть впоследствии нековалентно связан и использоваться для immunprecipitation.

Несмотря на хорошие сопряжения антитела, первоначального обнаружения бисером, связанные флуоресценции может быть низким. Во-первых, комплекс захватить само по себе может быть низкой. Поскольку IP-FCM зависит от концентрации аналитов, увеличивая количество клеток лизируется на единицу объема лизиса может увеличить аналита захвата и обнаружения. Кроме того, захват может быть повышена за счет уменьшения количества IP бисером инкубировали с лизат, которая распределяет захватили комплексов по всей меньше бисера и приводит к увеличению средней флуоресценции за борт, когда исследовали. Во-вторых, не исключено, что доступ зонд антитела к захватили комплексов пространственно затрудненные по immunoprecipitating антител. В этом случае проблема может быть решена с помощью различных антител для захвата и / или зонда.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)	Reagent	Interfacial Dynamics	2-5000	Store at 4°C.
Rainbow Calibration Particles	Reagent	Spherotech, Inc.	RCP-30-5A	Store at 4°C.
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)	Reagent	Sigma-Aldrich	M-5287
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)	Reagent	Sigma-Aldrich	22980 E-6383	Store at -20°C under desiccating conditions.
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	P-2714	Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves.
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney	Reagent	Fisher Scientific	08-408-230	For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining