Прямой анализ отдельных клеток методом масс-спектрометрии при атмосферном давлении

Резюме

Одноместный анализ ячейке осуществляется методом масс-спектрометрии на растительных и животных клеток при атмосферном давлении с помощью заостренной оптическому волокну образец клеток для лазерной абляции электрораспылением ионизации (LAESI) масс-спектрометрии.

Аннотация

Анализ биохимических в одиночных камерах важно для понимания клеточный метаболизм, клеточный цикл, адаптация, болезненных состояний и т. д. Даже те же типы клеток выставку гетерогенных биохимический состав в зависимости от их физиологических условиях и взаимодействия с окружающей средой. Традиционные методы масс-спектрометрии (MS), используемых для анализа биомолекул в одиночных камерах полагаться на обширные подготовки образца. Удаление клетки из природной среды и обширные обработки образца могут привести к изменениям в клеточный состав. Окружающие методы ионизации позволяют анализа образцов в их родной среде и без серьезной подготовки образца. ¹ методы, основанные на середине инфракрасного (среднего ИК) лазерной абляции биологических материалов на длине волны 2,94 мкм использовать внезапного возбуждения воды, что приводит к фазе взрыв. ² Окружающие методы ионизации на основе среднего ИК лазерного излучения, таких как лазерная абляция электрораспылением ионизации (LAESI) и атмосферное давление инфракрасную матрицы-активированная лазерная десорбция ионизации (AP ИК-MALDI), успешно продемонстрировали возможность непосредственного анализа воды богатые ткани и biofluids при атмосферном давлении. ^3-11 В LAESI среднего ИК лазерной абляции шлейфа, которые в основном состоит из нейтральных твердых частиц из пробы, сливается с весьма напряженной электрораспылением капель для производства ионов. В последнее время среднего ИК абляции отдельные клетки была выполнена за счет предоставления среднего ИК-излучения через травление волокна. Шлейф информации из этой абляции postionized по электрораспылением позволяет анализ различных метаболитов в отдельных клеток от LAESI-МС. ¹² В этой статье описывается подробный протокол для одного анализа клеток с использованием LAESI-МС. Представлены видео демонстрирует анализ одной эпидермальной клетки из кожи Allium сера лампы. Схема системы показана на рисунке 1. Типичный пример одного удаления клеток и спектр LAESI массой от ячейки предоставляются на рисунке 2.

протокол

1. Оптические компоненты

1. Лазерной абляции для лазерной абляции электрораспылением ионизации (LAESI) масс-спектрометрии (MS) производится 5 нс лазерного импульса на 2,94 мкм длиной волны. Перестраиваемый оптический параметрический генератор управляется Nd: YAG лазера (Opolette 100, Opotek Inc, Карлсбад, Калифорния) используется для абляции в данном исследовании. Частота повторения выбирается от 5 до 100 Гц. Это лазер класса IV, что при прямом воздействии может привести к серьезному повреждению глаз или кожи. Диффузного отражения лазерного луча также может быть опасно для кожи и глаз. Надевайте соответствующие очки лазер для защиты.
2. Оптического волокна сделаны из диоксида германия основе стекла была получена из инфракрасных Fiber Systems, Inc (Silver Spring, MD). Если Есть Hytrel и полиимидных покрытий на волокна следуйте инструкциям ниже, чтобы удалить их из концов. Тепло 1-метил-2-пирролидон на 130-150 ° С в вытяжном шкафу. Dip концов волокон вы хотите полосу в этой жидкости в течение примерно 1 мин или пока покрытие начинает смягчаться и шелушиться. Падение смягчил покрытия в метанол или изопропиловый спирт на минуту, и протрите все оставшиеся покрытие с безворсовой салфеткой. После снятия покрытия, расщепляющие обоих концах волокна с сапфиром лезвия (Kitco волоконной оптики, Вирджиния Бич, Вирджиния), забив и мягко щелкая их.
3. Для достижения желаемого резкость, химически травления одного конца волокна наконечник на 1% (об. / об), азотной кислоты (реагент класс) решение. Вертикально погрузиться выбран конце волокна в кислотный раствор на глубину от 300 до 500 мкм после первого контакта. Примерно через 15 минут после травления, наконечник самопроизвольно отключаться от кислоты поверхности. Это приводит к заостренным наконечником волокна с ~ 15 мкм, радиус кривизны. Полоскание с деионизированной водой для удаления остатков кислоты.
4. Горы травления конца волокна на микроманипулятора (MN-151, Narishige, Токио, Япония) и довести его до непосредственной близости (~ 20 мкм) на поверхности клеток для эффективного осаждения энергии.
5. Держите без травления конце оптического волокна голого волокна патрон (BFC300, Сиския Corporation, Грантс-Пасс, ИЛИ). Для оптического выравнивания, волокна патрон установлен на пять оси переводчик (BFT-5, Сиския Corporation, Грантс-Пасс, ИЛИ). Лазерной энергии (от 0,5 до 1 мДж) вводится в волокно путем фокусировки луча от плоско-выпуклую фторида кальция или просветляющие покрытие линз ZnSe (инфракрасный оптический Продукты, Farmingdale, Нью-Йорк) на его без травления конца. Охраняемые золотых зеркал (PF10-03-M01, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) используются, чтобы управлять среднего ИК лазерного луча на фокусирующей линзы.

2. Электроспрей установки

1. Электрораспылением системы можно построить, используя следующие компоненты: металлическое соединение с проводящим наконечником perfluoroelastomer, фитинги, трубы втулки, игольчатые порт (например, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, соответственно IDEX здравоохранения и наук, Дуб Харбор, Вашингтон), так как плавленый диоксид кремния трубки (например, CT360-100 50 пять Нью Цель Инк, Woburn, Массачусетс). Рекомендуется излучателя выполнен из нержавеющей стали и имеет конический наконечник с 50 мкм идентификатор (например, MT320-50-5-5, Новая цель Inc, Woburn, MA).
2. Подготовка 50% раствора метанола с 0,1% уксусной кислоты (об. / об) для электрораспылением. Раствор перекачивается в размере от 200 до 300 Нл / мин шприцевой насос (Harvard Аппарат, Холлистон, М. А.), используя, например, 500 мкл шприц (81 222, Гамильтон компании, Рино, штат Невада).
3. Применение высокого напряжения между 2800 и 3000 В до металлическое соединение по регулируемому источнику питания (PS350, Stanford Research Systems Inc, Саннивейл, Калифорния), чтобы создать устойчивый электрораспылением. Убедитесь, что все электрические соединения выполнены надежно и экранированных с экранированием заземлены. Прямой контакт с открытыми высокое напряжение может привести к поражению электрическим током.

3. Пример обработки

1. Получить жить тканей или клеток выборки из соответствующего источника и держать их в соответствии с рекомендациями перед анализом. Allium сера луковицы для этой демонстрации были приобретены у местного магазина. Вырезать луковица продольно от хирургического скальпеля. Несколько сегменте сантиметр шкала подразделяется на полосу. Нетронутым монослой внутренней эпидермальный ткань снимают.
2. Мокрой поверхности эпидермиса используется для монтирования ткани на предварительно очищенное микроскопический слайд стекла. Держите слайд общим держателем пластины назначения (FP01, Thorlabs Inc, Ньютон, штат Нью-Джерси), установленных на трехосной перевод почву для позиционирования. Приобретать масс-спектры сразу же после монтажа образцов для предотвращения деградации ячейки.

4. Система визуализации

1. Две длинные расстояния микроскопы используются для выбора элементов для анализа и для поддержания расстояния между заостренным наконечником волокна и клеточной поверхности. Последний устанавливается под 15 ° -30 ° угол, отсчитываемый от поверхности. Эта система состоит из др.Онг расстоянии видео микроскопа (7x оптическим зумом точность, Эдмунд оптики, Баррингтон, штат Нью-Джерси) с 5-кратным бесконечности исправлены объектива (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Ко, Канагава, Япония), оснащенных ПЗС-камеры (Marlin F131, Allied Видение Технологии , Stadtroda, Германия) для мониторинга и захвата изображений.
2. Второй видеомикроскоп устанавливается под прямым углом к ​​поверхности образца для визуализации клетки сверху. Эта система обеспечивает визуальную обратную связь для юстировки волокна опрокинуться клетка выбрана для абляции и анализа. Он состоит из 7-кратным оптическим зумом точностью (Эдмунд оптики, Баррингтон, штат Нью-Джерси), оснащенный 10-кратным бесконечности исправлены долгого рабочего линзы расстоянии цели (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Ко, Канагава, Япония) и ПЗС-камерой.

5. Приобретение масс-спектрах

1. Включите лазер, электрораспылением и масс-спектрометра, например, квадрупольный время пролета системы (Q-TOF премьер, Воды, Милфорд, штат Массачусетс). Оптимизация геометрии ионного источника LAESI, регулируя положение пятна абляции и электрораспылением излучателя по отношению друг к другу и отверстие масс-спектрометр для достижения максимальной интенсивности ионов.
2. Выберите ячейку, представляющие интерес для анализа с помощью верхнего зрения системы визуализации. После выбора, перемещения образца этапе довести выбранную ячейку непосредственно под заостренным кончиком оптического волокна. Использование бокового обзора микроскопа корректировке носа до поверхности клетки расстояние до ~ 20 мкм.
3. Пожар лазерных импульсов на выбранной ячейки по травлению кончик волокна. Это приводит к перфорации клеточной стенки и выброс в цитоплазму в виде твердых частиц. После postionization по электрораспылением, образующихся ионов собираются масс-спектрометр и масс-спектры записаны.
4. После сбора данных, поставить лазер, электрораспылением и масс-спектрометра в режиме ожидания или выключать их. Держите удаленной А. сера образец ткани для дополнительных наблюдений с помощью световой микроскопии.

6. Представитель Результаты

Успешное удаление отдельных результатов ячейку в лопнул клеточную стенку и набор масс-спектр LAESI. Неудачного эксперимента обычно не приводит к абляции и / или не масс-спектре. Для демонстрационных целей, мы представляем результаты LAESI-МС анализа одного встроенного эпидермальный ячейке А. сера лампочки. На рис.2 показаны представитель оптического изображения микроскопии после отбора проб клеток. Клеточная стенка перфорированные и степени перфорации ограничено границ с соседними клетками. Соседние ячейки кажутся нетронутыми. Рисунок 2б показывает, представитель массы LAESI спектр производится из клетки. Широкий спектр ионов обнаруживаются от А. сера клеток и на основе их точные массы, структуры изотопа распределения, и, в некоторых случаях и тандемной масс-спектры, они предварительно назначены эндогенных метаболитов. Ионы обнаружены из одной клетки были похожи на те, наблюдается в анализе той же ткани обычными LAESI-MS нескольких ячеек ^13.

Рисунок 1. Схема одного анализа ячейки LAESI-МС. Среднего ИК лазерного импульса вводится в оптическое волокно и доставляется образец на стекле. Заостренным наконечником волокна фокусирует свет в клетки-мишени и хранение энергии всплесков клетки. Производится удаление шлейфа (красные точки) сливается с электрораспылением шлейфа (черные точки) капли сливаются (зеленые точки), в результате образец конкретного производства иона. Эти ионы анализируются и обнаружено масс-спектрометр (MS). Две большие расстояния видео микроскопы, микроскоп 1 и 2 микроскоп, используются для контроля расстояния между острием волокна и на поверхности клеток и выбрать ячейку для анализа, соответственно.

На рисунке 2а. Абляция отпечаток на одну ячейку эпидермальный А. сера лампочки. Соседние ячейки не проявляют видимых повреждений, а затем могут быть проанализированы отдельно.

На рисунке 2б. Масс-спектр соответствует удаление одного A. сера эпидермальный ячейка показывает наличие первичных и вторичных метаболитов.

Обсуждение

Содержание воды в цитоплазме клеток и прочность на разрыв клеточной стенки или мембраны являются критическими факторами, определяющими удаление одиночных камерах в течение LAESI-МС анализа. Лазерной энергии должен быть отрегулирован для достижения аблации пороги различных типов клеток. Доставлен лазерной энергии зависит от энергии лазерного импульса и от расстояния между кончиком волокна и клеточной поверхности. Минимизация возмущений соседних клеток в течение одного анализа клетка имеет решающее значение. Сохранение энергии лазерного излучения на порог абляции ограничивает эффект анализ на соседние ячейки.

Одно из потенциальных применений использует отдельные клетки как естественный объемный пикселей (вокселей) для химической изображений РС. По сравнению со сбором данных по искусственным часто прямоугольной сетки, химической визуализации тканей одной ячейки в то время, скорее всего, сохранит пространственная организация биохимических взаимодействий между клетками.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Fluka	45727
Methanol	Fluka	65548
1-methyl-2-pyrrolidinon	Sigma-Aldrich	M79603
Water	Fluka	39259