Выделение клапанные эндотелиальных клеток

Резюме

Мы предлагаем метод выделения и культивирования чистых популяций клапанов сердца эндотелиальных клеток (VEC). VEC может быть изолирован от обеих сторон пороге или листовку и сразу после, лежащие в основе интерстициальная клетка (ВМЦ) изоляции прост.

Аннотация

Сердце клапаны полную ответственность за сохранение однонаправленный поток крови через сердечно-сосудистой системы. Эти тонкие, волокнистые ткани подвергаются значительным механическим нагрузкам, как они открываются и закрываются в несколько миллиардов раз срок службы. Невероятная выносливость этих тканей происходит из-за резидентом клапанной эндотелия (VEC) и интерстициальные клетки (ВМЦ), которые постоянно ремонта и реконструируют в ответ на местные механические и биологические сигналы. Только недавно мы начали понимать уникальное поведение этих клеток, для которых в лабораторных экспериментов сыграло ключевую роль. Особенно сложным является изоляция и культуры VEC. Особое внимание должно быть использовано с момента ткань удаляется от хоста через окончательного покрытия. Здесь мы представляем протоколы для прямого изоляции, боковые конкретных изоляции, культуры, и проверка чистых популяций VEC. Мы используем ферментативного пищеварения следуют нежный технику соскабливания тампон, чтобы выбить только клетки поверхности. Эти клетки затем собирают в трубку и центрифугировали в гранулах. Осадок затем ресуспендировали и высевают в культуру колбы предварительно покрытых с коллагеном I матрицы. VEC фенотип подтверждается контакт ингибирует рост и экспрессию эндотелиальных специфических маркеров, таких как PECAM1 (CD31), фактор фон Виллебранда (фВ), и негативные выражения альфа-актин гладких мышц (α-SMA). Функциональные характеристики VEC связаны с высоким уровнем ЛПНП ацетилированного. В отличие от сосудистых эндотелиальных клеток, VEC имеют уникальную способность трансформироваться в мезенхимы, которое обычно происходит во время эмбрионального формирование клапана ^1. Это также может произойти во время значительно увеличивал сливной должность в пробирке культуру, поэтому следует позаботиться должны быть направлены на прохождение в или около слияния. После выделения VEC, чистых популяций VIC могут быть легко приобретены.

протокол

1. Подготовка

1. Автоклав в закрытом лотке инструментов следующие пункты:
   1. Зазубренные ткани щипцы - для обработки тканей листовки
   2. Ткань ножницы (8 см) - для обрезки ткани буклета, а также точками возврата
   3. Ватные тампоны - для выделения эндотелиального слоя из буклет или параболическими
2. Сделать стерильный раствор коллагеназы
   1. Добавить 4,0 г порошкообразной DMEM до 250 мл 18 МОм воды.
   2. Добавить 1,11 г натрия бикарбоната.
   3. Добавить (600 ЕД / мл), 180 000 единиц коллагеназы.
   4. Добавить 1% (3 мл) Пенициллин / стрептомицин.
   5. Отрегулируйте рН раствора до 7,2.
   6. Доведите раствор до 270 мл.
   7. Стерилизовать раствор, проходя через фильтр 0,2 мкм.
   8. Добавить 10% (30 мл) стерильной эмбриональной телячьей сыворотки.
3. Сделать стерильной среде эндотелиальные клетка
   1. Добавить 6,7 граммов порошкообразного DMEM до 400 мл 18 МОм воды.
   2. Добавить 1,85 г натрия бикарбоната.
   3. Добавить (50 ед / мл) 25000 единиц гепарина.
   4. Добавьте 1% (5 мл) Пенициллин / стрептомицин.
   5. Отрегулируйте рН раствора до 7,2.
   6. Доведите раствор до 450 мл.
   7. Стерилизовать раствор, проходя через фильтр 0,2 мкм.
   8. Добавить 10% (50 мл) стерильной эмбриональной телячьей сыворотки.
4. Сделать стерильной среде интерстициальная клетка
   1. Добавить 13,37 граммов порошкообразного DMEM до 800 мл 18 МОм воды.
   2. Добавить 3,7 г натрия бикарбоната.
   3. Добавить 1% (10 мл) Пенициллин / стрептомицин.
   4. Отрегулируйте рН раствора до 7,2.
   5. Доведите раствор до 900 мл.
   6. Стерилизовать раствор, проходя через фильтр 0,2 мкм.
   7. Добавить 10% (100 мл) стерильного бычьего сывороточного.

2. Выделение Листовки клапанов сердца

1. Акцизный корня аорты сразу и асептически из сердца после жертвоприношения.
2. Тщательно промойте корня аорты крови с холодного стерильного DPBS. Крайне важно, чтобы удалить все компоненты крови как можно скорее ограничить VEC смерти и бактериального загрязнения. Антибиотики и противогрибковые не советуют на этом этапе, так как они являются потенциально опасными для VEC.
3. Изолировать створок (3 на клапан) прямо с корнем и место в стерильные 15 мл коническую трубку, наполненную 12 мл холодной DPBS. Встряхните несколько раз, чтобы убрать мусор и пополнить свежими DPBS.
4. Транспорт в лабораторию на льду.
5. По прибытии в лабораторию, поместите контейнер с тканью под стерильный капотом.

3. Выделение слоя эндотелиальных

1. Заполните стерильные 35 мм блюдо с 3 мл холодного раствора коллагеназы на клапан (3 листовки).
2. Поместите все три листовки от 15 мл трубку в блюдо заполнено коллагеназы решение.
3. Инкубируйте ткани в течение 5-10 минут при температуре 37 ° C.
4. Аккуратно снимите слой эндотелиальных поворотом сухих стерильных тампона на поверхность листовку. Направление вращения и количество сдвига применяется крайне важно для чистоты вашего образца. Вращение тампона должны быть в обратном направлении к линейным движением руки создания контролируемого сдвига. Этот сдвиг является то, что подъемники эндотелиальных клеток из ткани. Количество силы, приложенной должно быть достаточно, чтобы чувствовать сопротивление тканей, но не проникают базальной мембраны.
5. Иногда, приложите тампон внутри коллагеназы решение сместить клетки от кончика волокна. После моечные завершения текстуру эндотелиальных слой должен чувствовать себя немного более гладкой, чем раньше.
6. Сбор суспензии клеток / коллагеназа и трансфер в новые стерильные 15 мл трубки.
7. Центрифуги трубы при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут, чтобы гранулы любых изолированных клеток и аспирации супернатант. Если изоляция интерстициальные клетки, а также, выполнять этот протокол, в то время как эти клетки в настоящее время центрифугировали.
8. Добавьте 3 мл эндотелиальных среды свиней на 15 мл пробирок, центрифуги второй раз, и аспирата СМИ. Это второй центрифугирования помогает фильтр некоторых нежелательных материалов, таких как кончик волокна.
9. Повторное приостановить центрифугировали эндотелиальных клеток в 5 мл эндотелиальных среду свиного и пластины клеток в предварительно покрытых Т-25 колбу с коллагеном (используйте 1 флакон в центрифуге трубки).
10. Пусть клетки растут по крайней мере за 2-3 дня до изменения эндотелиальных среды. Это помогает клеткам восстановиться и разделить с изоляцией процесс довольно жесткие и клетка выход может быть низким. Очень важно, чтобы переход клетки возле слияния с контактного торможения может привести к клеточной трансформации.

4. Подготовка 60 мм культуры Блюдо для стороны Конкретные Изоляция

1. Линия 60 мм стеклянных чашках Петри с алюминиевой фольгой (2 стеклянная посуда в leafleт). Алюминиевой фольги помогает снять парафин, таким образом, чтобы стеклянном блюде Петри могут быть повторно использованы для других выделений.
2. Место парафин бисером в блюдах, около половины полном объеме, и крышка для автоклавирования.
3. После автоклавирования, является полной и парафин расплавляется, переместить блюдо ансамбля в прохладное плоской поверхности. Как парафин остынет, он затвердеет и создать слой, который будет поддерживать иглой проколы.
4. Через 30 минут стерилизовать блюдо может быть использован в качестве изоляции камеры для иммобилизации листовки ткани.

5. Выделение сторона Конкретные Эндотелиальная слоя

1. Удалить листовки от 15 мл пробирки и поместите на подготовленную 60мм блюдо культуры стороне конкретные изоляции.
2. Манипулирование листовки, чтобы ventricularis сторона лицевой стороной вниз на поверхности парафина оставив стороне фиброзный подвергается. Pin края листовки подвергать эндотелиальных слоя.
3. Поместите несколько капель холодной коллагеназы на каждом (вверх-облицовки) эндотелиальных поверхность и инкубировать ткани в течение 5-10 минут при температуре 37 ° C.
4. Как и прежде, аккуратно удалить слой эндотелиальных поворотом сухих стерильных тампона на поверхность листовку. Направление вращения и количество сдвига применяется крайне важно для чистоты вашего образца. Вращение тампона должны быть в обратном направлении к линейным движением руки создания контролируемого сдвига. Этот сдвиг является то, что подъемники эндотелиальных клеток из ткани и больше ничего. Количество силы, приложенной должно быть достаточно, чтобы чувствовать сопротивление ткани, но, не проникает в ткани.
5. Иногда, приложите тампон внутри коллагеназы решение сместить клетки от кончика волокна. После моечные завершения текстуру эндотелиальных слой должен чувствовать себя немного более гладкой, чем раньше.
6. Сбор суспензии клеток / коллагеназа и трансфер в новые стерильные 15 мл трубки. Укажите сторону специфику на этикетке (листовки с того же клапан может быть объединены вместе).
7. Передача листовки новое блюдо культуры, чтобы ventricularis сторона в настоящее время подвергается и повторите шаги (5.3-5.6).
8. После того как все клеточной суспензии / коллагеназа собирается, центрифуги трубы при 1000 оборотов в минуту для 5 минут, чтобы гранулы любых изолированных клеток и аспирации супернатант. Если изоляция интерстициальные клетки, а также, выполнять этот протокол, в то время как эти клетки в настоящее время центрифугировали.
9. Добавьте 3 мл эндотелиальных среды свиней в трубах, центрифуги второй раз, и аспирата СМИ. Это второй центрифугирования помогает фильтр некоторых нежелательных материалов, таких как кончик волокна.
10. Повторное приостановить центрифугировали эндотелиальных клеток в 5 мл эндотелиальных среду свиного и пластины клеток в предварительно покрытых Т-25 колбу с коллажем (используйте 1 флакон в центрифуге трубки).
11. Пусть клетки растут по крайней мере за 2-3 дня до изменения эндотелиальных среды. Это помогает клеткам восстановиться и разделить с изоляцией процесс довольно суровым. Если вы заметили, доходность будет очень низкой, рассмотреть вопрос о переходе к меньшим колбу или хорошо пластины с межклеточной адгезии способствует росту клеток. Не забудьте проход возле слияния с контактного торможения может привести к клеточной трансформации.

6. Выделение интерстициальные клетки

1. Заполните стерильные 15 мл центрифужную пробирку с 10 мл раствора на коллагеназы клапана (3 листовки).
2. После моечные листовки эндотелиальных клеток, сразу же поместить их в соответствующие 15мл трубка с коллагеназы решение.
3. Инкубируйте в течение примерно 12 до 18 часов (мягко агитировать по желанию).
4. Смешайте деградированных ткани осторожно серологические пипетки до клеточной суспензии / коллагеназа становится гомогенизации. Это гомогенизации помогает разрушить ткань и освободить интерстициальные клетки.
5. Центрифуга переваривается ткани в течение 5 минут при 1000 оборотах в минуту и ​​аспирации супернатант.
6. Добавьте 5 мл интерстициальная среда свиней на 15 мл пробирки, центрифугируют второй раз, и аспирата supernate.
7. Повторное приостановить центрифугировали эндотелиальных клеток в 5 мл интерстициальная среда свиней и пластины клеток в Т-75 колбе (используйте 1 флакон в центрифуге трубки).
8. Пусть клетки растут по крайней мере за 1-2 дня до изменения интерстициальной среда клетки. Там будет гораздо больше мусора, чем ткани с эндотелиальных клеток, но, что не ожидается. Клетки также должны вырасти до слияния быстрее, чем эндотелиальные клетки из-за выхода клеток и их характер.

7. Представитель Изображения

Рисунок 1. Морфологии изолированных клеток на 2-3 дней после изоляции. (А) VEC выставке типичной морфологией и эндотелиальных образуют кластеры, чтобы стимулировать экономический рост. (B) VIC морфологии похож на миофибробластов которые обычно веретенообразную форму и распространяться равномерно в течение колбу.

Рисунок 2. Морфологии изолированных клеток слияния. (А) VEC выставке типичной морфологией эндотелиальных которые, как правило, булыжник и роста контакт запрещена. (B) VIC морфологии похож на миофибробластов которые обычно веретенообразную форму, а не рост контакт запрещена.

Рисунок 3. Функция характеристики изолированных клеток ^6. (А) VEC связаны с высоким уровнем ЛПНП ацетилированного поглощения (красный). (B) ВИК связаны с низким уровнем ЛПНП ацетилированного поглощения.

Рисунок 4. Сотовой маркеров изолированных клеток ^6. (А) VEC фенотип способствовало положительное окрашивание на фактор фон Виллебранда (зеленый), синий (ядер). (B) VIC фенотип способствовал негативный окрашивание на фактор фон Виллебранда.

Рисунок 5. Сотовой маркеров изолированных клеток. (А) VEC фенотип способствовала отрицательная окраска для альфа-SMA (зеленый), синий (ядер). (B) VIC фенотип способствовало положительное окрашивание для альфа-SMA.

Диссоциация агент	Диссоциация Техника	Сотовые коллекции	Количество сотовых	Ячейка Чистота	Загрязнение
ЭДТА (3 мм) без CaCl 2	5, 20, 60 мин. до того CaCl 2	20, 60, 120 мин. до сбора	-	+ / -	+ + +
ЭДТА (6 мм) без CaCl 2	5, 20, 60 мин. до того CaCl 2	20, 60, 120 мин. до сбора	+ / -	+	+ + +
Трипсин-EDTA (0,5 г / л)	5, 10, 15 мин. до деактивации	Средний собраны сразу	+	+	+ +
Коллагеназы II (300 ЕД / мл)	5, 10, 15 мин. до деактивации	Средний собраны сразу	-, +, + +	-, + + +	+
Коллагеназы II (600 ЕД / мл)	5, 10, 15 мин. до деактивации	Средний собраны сразу	+, + + + + +	+ +, + +, -	-

Таблица 1. Результаты предварительных клапанной эндотелиальных протоколов изоляторе.

Обсуждение

Понимание клапанной биологии была нарушена технические трудности выделения и культивирования чистых популяций клапанной эндотелиальных клеток. Типичные методы изоляции включают ферментативного переваривания основных базальных матрицы или химической диссоциации эндотелиальных о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	50-103-PB
Fetal Bovine Serum	GIBCO, by Life Technologies	26140
Penicillin Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
0.25% Trypsin-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25200
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	H4784-1G
Collagenase Type 2	Worthington Biochemical	LS004176
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	21300-058
Rat Tail Collagen	BD Biosciences	354236
Critical Swabs	VWR international	89031-270
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	55761
T25 Flasks	BD Biosciences	353018
T75 Flasks	BD Biosciences	353136
24 Well Plate	Falcon BD	353047
60x15 mm Dishes	VWR international	25384-092
60x15 Glass Dishes	VWR international	89000-310
Paraffin Embedding Wax	Electron Microscopy Sciences	19304-01
Precision Glide Needles	BD Biosciences	305165
500 mL Nalgene Filters	VWR international	73520-985
1L Nalgene Filters	VWR international	73520-986
Tissue Forceps	Fine Science Tools	11023-15
FSC Tweezers #5	Fine Science Tools	11295-00