Выделение и культуры Птичий Эмбриональные клетки-предшественники клапанные

Резюме

Эта статья даст метод выделения и культивирования перепелиных или куриных HH14 ^- Клапан эндокарда клеток и HH25 клапан подушки мезенхимальных клеток.

Аннотация

Правильное формирование и функции эмбриональных сердечных клапанов имеет решающее значение для развития прогрессии. Раннем эмбриональном сердце U-образной формы из эндокарда окружении миокарда. Миокарда выделяет сердечного желе, гиалуронана богатых желатиновой матрице, в атриовентрикулярного (АВ) соединения и выходного тракта (OFT) просвета. На этапе HH14 valvulogenesis начинается тогда, когда подмножество эндокарда клетки получают сигналы из миокарда, эндокарда, чтобы пройти мезенхимальные трансформации (EMT), и вторгаться в сердечной желе. На этапе HH25 клапанной подушки полностью mesenchymalized, и именно это мезенхимы, что со временем формы клапанного аппарата и перегородки сердца. Понимание механизмов, которые инициируют и модулировать процесс дифференциации EMT и клеточной важны, потому что их связи с серьезными врожденными пороками сердца. В этом исследовании мы представляем методы, чтобы изолировать предварительно ЕМТ эндокарда и пост-EMT мезенхимальные клетки, которые являются двумя различными фенотипами ячейки prevalvular подушке. Предварительно ЕМТ эндокарда клетки можно культивировать с или без миокарда. После ЕМТ А. В. подушке мезенхимальных клеток можно выращивать внутри механически ограничены, или без стресса гели коллагена. Эти 3D-модели в пробирке имитировать ключевых событий клапанной морфогенный и полезны для деконструкции механизмы ранней и поздней стадии valvulogenesis.

протокол

1. Подготовка

1. Инкубируйте плодородной перепелиные или куриные яйца на стадии 14 ^- (около 2 дней) или 25 (около 4,5 дней) при 60% влажности и 37 ° C.
2. Подготовка сбалансированный солевой раствор стерильной Графа (EBSS)
   1. Добавить 100 мл 10X EBSS до 600 мл воды 18 МОм
   2. Добавить 2,2 г бикарбоната натрия
   3. Отрегулируйте рН раствора до 7,2
   4. Доведите раствор до 1000 мл
   5. Стерилизовать раствор, проходя через фильтр 0,2 мкм
3. Подготовка стерильного M199 культуральной среде.
   1. Добавить 1 пакет порошка M199 до 700 мл 18 МОм воды.
   2. Добавить 2,2 г бикарбоната натрия
   3. Отрегулируйте рН раствора до 7,2.
   4. Добавьте 10 мл (1%) Пенициллин-Стрептомицин
   5. Доведите раствор до 1000 мл
   6. Стерилизовать раствор, проходя через фильтр 0,2 мкм
   7. Добавьте 1 мл стерильного 100X Инсулин-трансферрина-Селен-G дополнения
   8. Добавьте 10 мл (1%) стерильные сыворотки курица
4. Подготовка трехмерных гели коллагена на коллаген концентрации 1,5 мг / мл. Предыдущая работа в нашей лаборатории показали, что коллаген концентрации более 1,5 мг / мл дает матрицу, которая является слишком жесткой для биомеханически клеткам перемещаться по. Коллаген гель концентрации ниже 1,5 мг / мл так мало коллагеновых волокон, что клетка может комок клочок волокна локально, создавая острова клеток.
   1. Добавьте следующие ледяной реагентов для стерильной 15 мл центрифужную пробирку с целью:
      • 3X M199: Объем = общий объем необходимых / 3
      • Стерильные 18 МОм воды: Объем = общий объем необходимых (M199 громкость + курица сыворотке объем + 0,1 М NaOH громкость + коллаген объема)
      • Стерильные сыворотке курицы: Объем = общий объем необходимых * 0.01
      • Крыса хвостом коллагена I: Объем = (концентрация коллагеновый гель * суммарный объем необходимых) / коллаген фондовом концентрации
      • Стерильный 0,1 М NaOH: Объем = коллагена громкости * 0,2
        Примечание: количество воды, 0,1 М NaOH, и коллагена добавил будет варьироваться в зависимости от концентрации исходного раствора коллагена.
   2. Смешайте раствора коллагена хорошо стерильной пипеткой.
   3. Сразу передачи 0,3 мл раствора коллагена в 1,9 см ² скважины роста области. Этого достаточно, решение коллагена, чтобы полностью покрыть также и обеспечить гель, который составляет примерно 3 мм толщиной. Геля толщиной не менее 250 мкм необходимо для исследования клетка вторжения.
   4. Разрешить раствора коллагена в гель, по крайней мере 1 час при 37 ° C, 5% СО _2, и 100% влажности.

2. Предварительно ЕМТ эндокарда изоляторе и культуры

1. Эмбрион изоляции
   1. Место один дюйм длинный кусок лаборатории ленту больший конец яйца. Здесь воздушной камеры находится. Лента стабилизирует хрупкой яйцо перепелиное оболочки.
   2. Аккуратно прокол выявляются области яйцо в воздушную камеру с кончика стерилизовать изогнутые ножницы.
   3. Вырезать отверстие в пленку часть яйца, достаточно большой, чтобы желток, чтобы пройти. Начало отверстие прокола и сократить наружу в спиральную форму. Убедитесь в том, чтобы прорваться через внешнюю мембрану, но избежать пирсинг желток.
   4. Когда отверстие в корпусе завершена, визуализировать перепела эмбриона. Эмбрион, как правило, расположены на верхней стороне желтка.
   5. Начните влить желток через отверстие в яйце с одной стороны. Держите # 55 пинцет, с другой стороны. Как эмбрион выходит из яйца на верхней стороне желток, аккуратно сдвиньте # 55 пинцета под эмбриона и удалить его из желтка. Примечание: для куриных яиц, эмбрионов изоляции предполагает растрескиванию куриное яйцо на острый, чистую поверхность и разбивая яйцо в 100 мм блюдо Петри. Эмбриона должны быть расположены на верхней стороне желтка. Аккуратно вставьте # 55 пинцета под эмбриона и удалить его из желтка.
   6. Место эмбрион в 100 мм чашки Петри содержащие ледяной, стерильные EBSS.
2. Этап эмбрионов в соответствии с критериями Гамбургер и Гамильтон ^1. Эмбрионы на стадии 14 ^- это пройденный этап 13, но еще не на стадии 15, с 20-21 сомитов и хвост зародыше. Ключевой характеристикой стадии 14 ^- эмбрионов является главой угла, который чуть больше 90 ° к телу.
3. Удалить сердца от перепелиных эмбрионов на стадии 14 ^- с № 55 пинцетом за счет сокращения поперечно, где канал А.В. и OFT в контакт с грудной стенки. Место сердца вместе на одной стороне чашки Петри.
4. Сбор изолированных сердца стерильной пипетки передачи и поместить их в новую 100 мм чашки Петри заполнена стерильной, ледяной EBSS.
5. Вырезать OFTs А. В. каналов поперечно из желудочков с № 55 пинцета.
6. Раздел оставшиеся А. В. каналов и / или отток путей (OFTs) в продольном направлении.
7. Установите пипетку объемом 20 мкл. Используйте этот пипетки для аспирации шесть продольно-среза А. В. каналов и OFTs.
8. Выгнать А. В. каналов и OFTs на коллагеновый гель. Аспирируйте излишки EBSS с поверхности геля.
9. Используйте # 55 пинцет, чтобы ориентироваться эксплантов так они плоские и так сторону просвета лица коллагеновый гель. Постарайтесь не прокалывать коллагеновый гель с пинцета.
10. Через 2 часа при температуре 37 ° С и 5% CO _2, удалить миокарда из эксплантов с № 55 пинцета. Эндокарда клетки должны быть оставлены на поверхности коллагеновый гель. Кроме того, миокарде можно оставить на эксплантов. С миокарда удалены, эндокарда клеток не претерпевает ЕМТ без вмешательства. С миокарда настоящее подмножество эндокарда клетки превращаются в мезенхимы, но степень превращения можно модулировать с внешними факторами. Примечание: Даже если миокарда останется на, эксплантов должно быть разрешено по крайней мере 2 часа, чтобы приложить к геля до среды добавлены.
11. Добавить 0,4 мл M199 среду в каждую лунку содержащие эксплантов.
12. Культуры клеток при 37 ° С, 5% СО _2, и 100% влажности.

3. После ЕМТ А. В. Подушка Мезенхимальные изоляторе и культуры

1. Crack куриное яйцо на острый, чистую поверхность и разбить яйцо в 100 мм блюдо Петри. Эмбриона должны быть расположены на верхней стороне желтка. Возьмите эмбриона с № 5 пинцет, захватывая мембраны, окружающие эмбрион и затем поместить эмбрион в 100 мм чашки Петри со льдом, холодный, стерильный EBSS.
2. Этап эмбрионов в соответствии с критериями Гамбургер и Гамильтон ^1. Особенности стадии эмбриона 25 включают различные локтевых и коленных суставах и небольшая пигментация глаз.
3. Изолировать сердца от всех HH25 эмбрионов и место людям найти друг друга на одной стороне чашки Петри.
4. Сбор изолированных сердца стерильной пипетки передачи и поместить их в новую 100 мм чашки Петри заполнена стерильной, ледяной EBSS.
5. Изолировать А. В. региона от всех сердцах сразу. Место AVs вместе на одной стороне чашки Петри. Аккуратно агитировать А. В. регионе, чтобы удалить всю кровь, которая может повлиять жизнеспособности клеток.
6. Сбор изолированных AVs стерильной пипеткой передачи и поместить их в новую 100 мм чашки Петри заполнена стерильной, ледяной EBSS.
7. Последовательно изолировать от подушки AV. Убедитесь, что нет настоящего миокарда на А. В. подушки.
8. Сбор отдельных подушек с стерильной пипетки передачи и поместить их в стерильную центрифужную пробирку 15 мл.
9. Спиновые подушки на дно центрифужную пробирку на 15 мкг в течение 3 минут.
10. Используйте стерильные 1000 мл кончик, чтобы удалить как можно больше EBSS супернатант возможно, не нарушая подушки.
11. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-EDTA, которая была предварительно нагревают до 37 ° C. Разрешить подушки для инкубации в трипсина, пока они полностью не растворится, которая обычно составляет около 3-5 минут.
12. Добавить 100 мкл сыворотки, чтобы курица центрифужную пробирку, чтобы утолить трипсина.
13. Гранул клетки при 160 мкг в течение 5 минут. Удалить супернатант со стерильными, 1000 мкл наконечник.
14. Ресуспендируют клеток в 2 мл M199 средних и перемешать с помощью пипетки. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии рассчитывать на гемоцитометра и определить общее количество клеток, которые были выделены
15. Определите, сколько коллагена гели будут приниматься на основе числа клеток изолированы. Клетки должны быть покрыты при плотности 2 х 10 ^{5 клеток} / мл с 250 мкл объема геля.
16. Гранул клетки при 160 мкг в течение 5 минут. Удалить супернатант со стерильными, 1000 мкл наконечник.
17. Использование протокола, перечисленных выше, добавить 3X M199, вода, курица сыворотка, коллаген, и 0,1 М NaOH, в таком порядке, чтобы осадок клеток. Смешать, осторожно пипеткой.
18. Добавьте 250 мкл каждого 1,9 см ² рост районе, хорошо.
19. Разрешить раствора коллагена в гель, по крайней мере 1 час при 37 ° C, 5% СО _2, и 100% влажности.
20. Добавить 0,4 мл медиа-культуры и инкубировать в течение ночи.
21. Продолжать культивирование гелей в свободной от стрессов условия, освободить гели от сторон культуры и использования стерильных 200 мкл кончика пипетки. Механически ограниченными культуры гели, которые остаются прикрепленными к сторонам культуры хорошо.

4. Представитель Результаты

Рисунок 1:. Примеры эмбрионов () HH14-перепела эмбриона, и (Б) HH25 куриного эмбриона показано здесь.

fig2.jpg "ALT =" Рисунок 2 "/>
Рисунок 2: HH14-клапанный эндокарда эксплантов через 2 часа культуры () с настоящим миокарда, или (В) с миокарда удалены..

Рисунок 3:. HH14-клапанный эндокарда эксплантов () В настоящее миокарда, многие из клетки подвергаются эндокарда к мезенхимальные трансформации и имеют веретенообразную, мезенхимальные фенотипа после 48 часов культуры. (B) Когда миокарда удалил все клетки поддерживать булыжником-образную форму, эндокарда фенотипа после 48 часов в культуре.

Рисунок 4:. HH25 клапан мезенхимальных клеток в коллагеновый гель Клетки округляются сразу после посева.

Рисунок 5:. HH25 мезенхимальных клеток в культуре () После 48 часов культуры в ограниченных коллагеновый гель HH25 мезенхимальные клетки начинают распространяться. (B) HH25 клеток в свободной от стрессов коллагеновый гель 7 дней после посева и 6 дней после освобождения у уплотненных гель примерно до 50% от первоначальной площади.

Обсуждение

Метод выделения эндокарда клетки из стадии HH14 ^- сердца, первоначально разработанная Раньян и Markwald обеспечивает контролируемое, в пробирке условия для изучения факторов, которые инициируют и модулируют эмбриональных ЕМТ ^2. HH14 ^- эндокарда эксплантов культурный без...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55	World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5	World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S
4-well culture plates	Nalge Nunc international	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane	Nalge Nunc international	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm	VWR international	25384-342
Laboratory tape	VWR international	89097-920
Rat-tail collagen I	BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution	Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder	Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)	Invitrogen	41400-045
Chicken serum	Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)	Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)	Cornell University Poultry Farm