Прижизненные микроскопия микроциркуляции мозга мыши, используя Закрытая черепно Window

Резюме

Прижизненные микроскопии следовать временным и пространственным гемодинамики и воспалительных явлений в пиальных микроциркуляцию.

Аннотация

Это экспериментальная модель была разработана для оценки мыши пиальных микроциркуляции при остром и хроническом, физиологических и патофизиологических гемодинамики, воспалительных и метаболических условиях, используя в естественных условиях флуоресцентной микроскопии. Закрытой черепно окно находится над левой теменно-затылочной коры мышей. Местные микроциркуляцию записывается в реальном времени через окно с помощью эпи и флуоресцентной подсветкой, и измерения диаметров судов и красных кровяных телец (эритроцитов) скоростей выполняются. РБК скорость измеряется в режиме реального времени кросс-корреляции и / или флуоресцентными меченых эритроцитов. Лейкоцитов и тромбоцитов приверженность мягкой мозговой оболочки сосудов и оценки перфузии и сосудистой утечки сделаны с помощью флуоресценции меченых маркеров, таких как альбумин-FITC и анти-CD45-TxR антител. Микроциркуляции может быть повторно видеокассету в течение нескольких дней. Мы использовали в первый раз закрыть окно мозга прижизненной микроскопии для исследования микроциркуляции пиальных следовать динамические изменения в ходе Plasmodium инфекции berghei ANKA у мышей, и показать, что выражение CM связано с нарушениями микроциркуляции характеризуется сужением сосудов, глубокое снижение артериального потоков и в конечном итоге сосудистого коллапса.

протокол

1. Краниотомия

Трепанация черепа в 8-к-10-недельных мышей должна быть выполнена заранее, как описано выше ^1, кроме того, что титан бар не помещается в голове животного. Хронические черепно окно стабильной подготовки позволяет рассмотрение пиальных микроциркуляцию даже месяцев после имплантации. Как правило, мы проводим наши исследования через 2-3 недели после имплантации черепных окна.

2. Прижизненные микроскопии

1. Два-три недели после трепанации черепа, температура тела, а затем проверили мышь слегка анестезировали изофлуран (4% для индукции, 1-2% за обслуживание). Свет анестезии используется для предотвращения стресса животных и дискомфорт во время эксперимента.
2. Животных помещали в положении лежа на стереотаксической рамы и головы тщательно крепится с помощью уха баров. Уровень регулируется с помощью правого и левого рычагов. Температура тела поддерживается использованием грелки. Потому что мыши с церебральной малярии развивать гипотермия, температура параметры должны быть скорректированы для каждого животного.
3. Покровным стеклом на черепные окном мягко очищают ватным тампоном, смоченным нефтепродуктов и панорамное изображение судов под окном берется с помощью стереомикроскопа и цифровой камерой (Nikon Coolpix 995, Япония). Изображение выводится на экран, идентифицированы и датированы и будет использоваться в качестве карты для измерения диаметра сосуда и красные кровяные клетки (эритроциты) скоростями.
4. Мышь затем переведен в прижизненной столик микроскопа (настраивается Leica-Макбейн, Сан-Диего, Калифорния). Капля воды помещается на черепные окна воспользовавшись хорошо образованные стоматологических акриловых, фокус настраивается. Измерения проводятся с использованием 20-кратный (LUMPFL-WIR, числовой апертурой 0,6, Olympus) цель погружения в воду. Же суда следуют, так что прямое сравнение их с исходным уровнем может быть выполнена, что позволяет более надежную статистику для малых популяций образца. Изображения получены с помощью цифровой низкой освещенности камера высокого скорости (Hamamatsu C9300-221, Япония), или низкой камеры аналог света (COHU 4815, Сан-Диего, Калифорния), подключенных к ленте видеомагнитофона (JVC, Япония), с временными метками (микроизображения Видео Системы, Бойертаун, штат Пенсильвания) и цветной монитор (PELCO, Кловис, штат Калифорния). Лента правильно определены до начала записи, и отметка времени позволяет идентифицировать события, документально время, через которое такие мероприятия были перекодировано.
5. Первая проверка судов производится для оценки качества подготовки и, если кровь течет во всех судах. Затем выбор судов для измерения производится и оно должно включать венул и артериол различного диаметра (в нашем мыши пиальных препаратов, большинство судов диапазоне от 20 до 80μm) и охватывают различные места в местах, подверженных воздействию у окна. Артериол и венул можно легко дифференцировать, проверяя направление кровотока в разветвления сосуда (будь то распространяет или собирает кровь). В наших исследованиях, измерения производятся в 12 судов. Точное местоположение каждого пятна на измеряемый аннотированные в картине пиальных сосудов.
6. Для каждого пятна, диаметр сосуда измеряется с помощью устройства сдвига изображения (Image сдвига, Vista электроники, Сан-Диего, Калифорния) ^2. Как только место выбрано, образ судна выравнивается в вертикальном положении, и изображение будет стриженого пока против крайностей выравниваются и чтения документации. Это значение может быть переведен на микрометров от предыдущей калибровки для каждого конкретного увеличения использования Сетка Микрометр этап калибровки (Эдмунд оптики Inc, Баррингтон, штат Нью-Джерси).
7. Каждое пятно регистрируется в течение не менее 30 секунд для эритроцитов слежения. Для слежения, образец крови собраны, и эритроциты флуоресцентно меченные красителем карбоцианиновых Дил (Molecular Probes, Карлсбад, Калифорния) и пропитала через хвостовую вену получить в естественных условиях концентрация ~ 0,4-0,5% ^3. У животных, инфицированных Plasmodium berghei ANKA (PBA), выражающая зеленый флуоресцентный белок (GFP-PbA, пожертвование от исследований малярии и справочных реагентов ресурсный центр MR4, Манассас, Вирджиния, сданный на хранение CJ Janse А. П. воды), настой не меченых ячейки необходимо. Видео изображения записываются со скоростью 150 кадров в секунду. Этот показатель устанавливается для получения 5:59 изображения ячейки на одной кадров при определении скорости до 8 мм / с Видео изображения оцифрованы с персональным компьютером с помощью Adobe Premier 4.0, а ху данные координат для каждой ячейки изображения получены с использованием SigmaScan Pro 4.0 программное обеспечение (SPSS Чикаго, Иллинойс) ^4. Сотовые положение которых определяется вручную, а не путем анализа изображения, учитывая, что глаз наблюдателя обучение было показано, чтобы дать хорошую оценку расположение в центре клетки,ч в целом соответствует положению максимальной флуоресценции наблюдалось во всех направлениях клетки. Несколько определения положения и скорости производится для каждой ячейки и в среднем для получения средней скорости РБК.
8. При измерениях РБК скорости выполняться в автономном режиме, суммарное время наблюдения для каждой мыши не превышает 10-15 минут минимизации кардиодепрессивного последствий анестезии.
9. Как только диаметр сосуда и измерения скорости РБК доступны, расчет кровотока в каждое судно может быть сделан по формуле: Q = V х π (D / ²⁾ 2, где Q = кровотока, V = РБК скорости и D = диаметр сосуда.
10. Эти процедуры можно повторять в течение долгого времени. Например, в мышиной модели церебральной малярии, мы выполняем ежедневные измерения, начиная с 4-й день инфекции. Значениями, полученными каждый день в течение каждой мыши нормированы по отношению ко дню 0 (до заражения), который считается 100%.
11. В дополнение к диаметра сосуда и измерений кровотока, дополнительные оценки могут быть выполнены, например, улучшение оценки перфузии и анализ лейкоцитов и / или тромбоцитов прокатки и присоединения в мягкой мозговой оболочки сосудов. Эти измерения проводятся с помощью люминесцентных меченых маркеров. В случае малярии, мы также можем обнаружить циркулирующие или приверженцем паразитов путем использования штамма PbA которая выражает GFP.
12. Для перфузионных оценки мы используем решения FITC-меченого альбумина (Sigma, St Louis, Миссури 50μg/mouse), и количественно лейкоцитов соблюдение пиальных судов мы используем антитела к пан-лейкоцитарный маркер CD45, меченных Texas Red (TxR) ( Invitrogen, Карлсбад, Калифорния 4μg/mouse). Для этого 25 мкл из альбумин-FITC (2mg/mL) и 20 мкл анти-CD45-PE антитела (200μg/mL) смешивают и вводят в подогретого хвостовую вену. Мышь может затем быть отображены немедленно, поэтому если утечка измерения займет альбумин-FITC разрешается циркулировать в течение 15 минут. Зеленый флуоресценции (518nm), испускаемых альбумин-FITC и GFP (PBA-GFP PRBC) захватывается использования и АЛЬФА Vivid: XF100-2 (Omega оптические, Brattleboro, VT), и анти-CD45-TxR флуоресценции (615nm) и выходе захватили с Vivid Стандарт: XF42.
13. Меченных флуоресцентными альбумина позволяет улучшить визуализацию сосудистой сети, в том числе проникающие сосудов, и это особенно полезно в болезненных состояний, таких как церебральная малярия, чтобы проверить, не перфузии или под-перфузии сосудов. Она также может быть использован для измерения сосудистой утечки ^5.
14. Флуоресцентные меченных анти-CD45 антител позволяют легко идентифицировать и количественно лейкоцитов качения и сцепления с мягкой мозговой оболочки сосудов. Чтобы избежать предвзятости в количественном, мы количественно качения и сцепления в том же пятна предопределенных для измерения кровотока. Количественная оценка адгезии лейкоцитов производится путем подсчета количества лейкоцитов в 100 мкм, длина судна. Роллинг можно измерить с помощью подсчета числа лейкоцитов путешествия со скоростью, значительно медленнее, чем скорость крови в том же 100 мкм длиной, в течение 30 секунд.

3. Представитель результаты

Рисунок 1. (Шаг 2,6) Фотографии мыши пиальных сеть сосудистых доступны через черепную окна.

Рисунок 2. (Шаги 3.1-3.5) Схематическое отображение созданных для прижизненной микроскопии мыши пиальных микроциркуляцию. 1: прижизненной микроскопии; 2: 20X погружения в воду цели; 3: источник света; 4a: цифровой низкой освещенности высокоскоростной камеры; 4b: аналоговая камера; 5: мышь в стереотаксической раме; 6: компьютерный монитор, 7: аналоговый комбайна монитор, показывающий, как изображение стрижки (стрелка) делается для измерения диаметра сосуда.

Рисунок 3. (Шаг 3,6-3,8) микрососудистой эритроцитов измерения скорости по мобильному слежения с высокой скоростью флуоресценции видеозаписей. Картинки для F являются последовательность изображений одного пиальных судна, показывая один движущийся РБК пересечения микроскопических разделителем поля камеры. Руководство определения кадр за кадром позиций из 15 или более ячеек через поле, с его предварительно откалиброванной расстояние, позволяет вычислить среднюю скорость РБК в каждого судна с помощью таблиц Excel.

Рисунок 4. (Шаг 3,9) Данные представитель эксперимент показывает изменения в пиальных кровотока с течением времени в Plasmodium berghei ANKA (PBA) зараженных мышей (п = 5) и в неинфицированных контрольных мышей (п = 5). В то время как у контрольных мышей пиальных кровотока является относительно стабильным с течением времени, PbA-инфицированных мышах показывают заметное снижение кровотокаво время мозгового развития малярии (день 6). Данные среднее ± SEM.

Рисунок 5. (Шаг 4,3) большое количество лейкоцитов приверженцем пиальных судов мыши инфицированных Plasmodium berghei ANKA, как показали окрашивания с анти-CD45-Texas Red флуоресцентных антител.

Обсуждение

Прижизненной микроскопии описаны здесь представляет собой уникальный и мощный инструмент для детального наблюдения пиальных микроциркуляцию в мышь. Это позволяет выделение отдельных артериол и венул и измерения изменений ряда параметров, таких как диаметре сосудов, РБК скорости, по...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865