Микроинъекция А. Эмбрионы aegypti получить Трансгенные комары

Резюме

В этом видео, Нийоле Jasinskiene демонстрирует методики, использованной для создания трансгенных комаров Aedes aegypti, которые являются переносчиками лихорадки денге. Методы правильной подготовки микроинъекции иглы, дегидратирующая эмбрионов, а также выполнение микроинъекции демонстрируются.

Аннотация

В этом видео, Нийоле Jasinskiene демонстрирует методики, использованной для создания трансгенных комаров Aedes aegypti, которые являются переносчиками лихорадки денге. Методы правильной подготовки микроинъекции иглы, дегидратирующая эмбрионов, а также выполнение микроинъекции демонстрируются.

протокол

Подготовка заранее микроинъекции

1. Кровь комаров кормить: для инъекций с понедельника по пятницу кормить самок на предыдущий четверг.
2. Подготовка стеклянной иглы с помощью программы 3 или 2 (см. материалы).
3. Укладка трубы для эмбрионов дрозофилы культуры флаконе. Влажная вата в низу, с мокрыми диск фильтровальной бумаги ее освещении.
4. Подготовка пластического скольжения покрытие, придерживаясь двухсторонней ленты в один конец. Обрежьте ленту покровным стеклом так, что оно заканчивается на краю крышки скольжения.
5. Подготовка нефти для сушки (см. материалы)
6. 150 мл пластиковый стакан с мокрой ваты в нижней, покрытой мокрым диск фильтровальной бумаги (80 мм Whatman), чтобы эмбрионы после инъекции.

Настройка принудительного укладки

1. Сбор крови 6-10 кормили самок с использованием аспиратора и передавать их на флаконе дрозофилы культуры с мокрым хлопком и фильтровальную бумагу.
2. Положите комаров обратно в insectory условиях в темноте, и позволить, чтобы отложить яйца в течение 1 ч и 15 мин.
3. Давайте взрослых летят в клетку и удалить фильтр диск бумаги с эмбрионами.
4. Для выстраиваются яйца, делать это под рассекает области. Использование тонких щипцов № 5 или штраф кисть, выберите темный серый-серый эмбрионов и устроить в линии на квадрате 3MM ватмане пропитанный водой. Все эмбрионы должны быть в той же ориентации, как инъекция должна быть у заднего полюса. Передний конец эмбриона немного шире, чем задняя. Сухой бумажный фильтр с эмбрионами, нажав сухой фильтровальной бумаги на него (мокрые вещи не будет прилипать к ленте). Для передачи яйца, инвертировать слайд, содержащий двухсторонней ленты и мягко давить яйца. Заднем конце яйца должны быть очень близко к краю двусторонний скотч.
5. ПЕРЕСУШИВАЙТЕ эмбрионов около 1 мин. при комнатной температуре. Они начинают немного ямочка, как они сухие.
6. Обложка сухие эмбрионов с галоидоуглеводородов масла, чтобы предотвратить дальнейшее высыхание.

Микроинъекции эмбрионы

1. Наиболее важным аспектом хорошей инъекции качество иглы (см. материалы).
2. Заполните игла с ДНК раствор вводят с помощью microloader. Очень мало инъекционного раствора необходимо: от 1 до 2 мкл.
3. Подключите иглы Transjector, которая контролирует время впрыска (Ману) и давление (600), и избыточное давление (250). Микроинъекция выполняется с помощью микроскопа с движущейся этапе (Leica) при увеличении х 10 и микроманипулятора. Если необходимо, поднял столик микроскопа может быть подготовить к укладке 4-5 слайды микроскопом. Место проведения покровным стеклом эмбрионов на приподнятой сцене. Inject эмбрионов горизонтально, чтобы предотвратить разрыв endochorion; проникновение должно быть у заднего полюса. Для инъекций, я держу иглу стационарных и перемещать столик микроскопа.
4. Inject 0.2-0.5 п раствора, что соответствует примерно 1-5% от объема эмбриона. Управление объемом впрыска, регулируя давление впрыска и время. Слегка поклонился, сушеного эмбрионы должны вернуть их напыщенный инъекции следующий вид.
5. Выберите эмбрионов из покровным стеклом с использованием тонких щипцов или тонкой кистью, и поместите их в пластиковый стакан с мокрым хлопком и мокрой фильтровальной бумаги. Обложка стакан с папиросную бумагу. Имейте в месте с резинкой по краю и вернуться к insectary условиях в течение 4 дней.

После инъекции

1. Через четыре дня после этого, осторожно поместите эмбриона бумаги, эмбрион стороной вниз, на воду в большие пластиковые коробки с небольшим количеством пищи. Эмбрионы люк в течение очень длительного периода: не выбрасывать культуры по крайней мере до 4-5 недель после инъекции.

Примечания

ДНК для инъекций

Плазмиды ДНК решение для инъекций выделяли с помощью плазмиды EndoFree комплект. Построить и помощник плазмиды смешать в правильной концентрации, осаждали izopropanol. Осадок промывают 70% этанолом до ресуспендирования в инъекции буфера. Перед инъекцией, чистой ДНК с использованием Millex-GV колонке.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape