Конкретные Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток использованием Rev-зависимый лентивирусов Векторный выражая зеленый флуоресцентный белок

Резюме

Мы разработали лентивирусов вектор, который обладает, в дополнение к Tat проблематику LTR, Rev-ответ элементов (РРЭ), которые могут регулируют экспрессию гена-репортера в ВИЧ-1 Tat и Rev-зависимым способом. Вектор разрешения специфической детекции репликации ВИЧ в живых клетках с помощью выражения GFP.

Аннотация

Большинство ВИЧ-реагировать векторов экспрессии на основе промоутер ВИЧ, длинный концевой повтор (LTR). Хотя реагировать на ранних белков ВИЧ, Тат, LTR также отзывчив на сотовые состояния активации и локальной активности хроматина, где интеграция произошла. Это может привести к высокой распространенностью ВИЧ-самодеятельность, и ограничил полезность LTR-журналистом, чтобы отметить ВИЧ-положительных клеток ^1,2,3. Здесь мы построили выражение лентивирусов вектор, который обладает, в дополнение к Tat проблематику LTR, многочисленные последовательности ДНК ВИЧ, которые включают Rev-ответ элемент и ВИЧ-сайтов сплайсинга ^4,5,6. Вектор был включен в лентивирусов вирус репортера, что позволяет очень специфической детекции репликации ВИЧ в живых клеточных популяций. Деятельность вектор измеряли экспрессию белка зеленой флуоресценции (GFP). Применение этого вектора, как сообщили здесь предлагает новый подход альтернативой существующим методам, таким, как на месте ПЦР или ВИЧ-антиген окрашивания, для выявления ВИЧ-положительных клеток. Вектор может также выразить терапевтических генов для основного или клинических экспериментов, чтобы целевая ВИЧ-положительных клеток.

протокол

1. Трансфекция плазмиды для производства Rev-зависимый лентивирусов Частицы

Установка: Rev-зависимый GFP лентивирусов вектор, НЛП-GFP-РРЭ-SA, был описан ранее ^4,5,6. Чтобы собрать в вирусную частицу, плазмиду contransfected в HEK293 Т-клеток с ВИЧ-1 упаковка построить, pCMVΔ8.2 (любезно предоставлены доктором Dider Trono), и плазмиды проведения VSV-G гликопротеин (pHCMV-G) . Трансфекции было проведено с использованием метода фосфата кальция.

Подготовка буферов: 10 х HBS (Hepes солевой буфер) готовили растворением 5 г Hepes, 8 г хлористого натрия, 0,37 г хлорида калия, 1 г декстрозы, 0,103 г Na ₂ HPO ₄ (безводный) в 100 мл H ₂ O. Алиготе the10 X HBS буфер в 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. Во время трансфекции, конвертировать 10 X HBS до 2 х HBS с H ₂ O (1: 5 разведение), а также регулирования рН в пределах от 7,05 - 7,12. (На 10 мл 2 х HBS, как правило, требует примерно 50 мкл 1М NaOH). Фильтры стерилизовать 2X буфера HBS, проходя через 0,22 мкм Millipore фильтр. CaCl ₂ буфера было сделано путем растворения CaCl ₂ в 10 Hepes мМ до окончательного 2М концентрации. Отрегулируйте рН до 5,8, фильтр стерилизуют буфера и хранить при 4 ° C.

Порядок действий:

1. За день до трансфекции, семена 2 х 10 ⁶ HEK293T клеток в 100 мм-Петри блюдо, и вырастить клетки на ночь в 10 мл DMEM + 10% ЭТС при 37 ° C, 5% СО _2.
2. На следующий день, удалить супернатант из клетки и замените 5 мл свежей DMEM + 10% FBS, непрерывно культуры клеток в течение 4 часов.
3. В 5 мл полистирола трубки, добавляют 480 мкл буфера HBS 2X.
4. Во второй трубки полистирола 5 мл, добавить 60 мкл 2М CaCl ₂ буфера, плазмиды ДНК и трансфекции ТЕ буфера (1 мМ трис, 25 мМ ЭДТА, рН 8,0) в общем объеме 480 мкл. Для каждого Петри блюдо, плазмиды должны быть добавлены в соотношении 10 мкг НЛП-GFP-РРЭ-SA, 7,5 мкг pCMVΔR8.3 и 2,5 мг pHCMV-G.
5. Добавить плазмиды ДНК-CaCl ₂ смеси по каплям 2 трубками X HBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Мелкий осадок будет форма.
6. Добавить 960 мкл смеси по каплям пипеткой к клеткам. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО ₂ за одну ночь.
7. На следующий день, удалите супернатант и добавить 10 мл свежей DMEM + 10% FBS, и постоянно инкубации клеток при 37 ° С, 5% СО ₂ за одну ночь.
8. Через 48 часа после трансфекции, урожай вирус удаляя супернатант и передачи его в 50 мл стерильные пробирки. Добавьте свежие 10 мл свежей DMEM + 10% FBS в каждой Петри блюдо и продолжать культуры в одночасье. Магазин вирус супернатант при 4 ° C.
9. Продолжайте урожай в 72 часа после трансфекции, собирая супернатант. Смешайте все супернатанты, и центрифуга супернатанты на уровне 500 мкг в течение 15 минут для осаждения и удаления ячейки мусора.
10. Супернатант собирали и фильтруют через 0,22 мкм Millipore фильтр. Вирус был также сосредоточен через гель-столбцов.

2. Концентрат вирусных частиц и определить вирусную Титр

1. Вирусные частицы были сосредоточены на гель-колонки (100 000 МВт отрезаны, Centricoin). Вирусный супернатант загружается в колонну, и центрифугировали при 6000 мкг при 4 ° С в течение 15 минут.
2. Концентрированный вирусных супернатант собирали, аликвоты и хранили при температуре -80 ° C.
3. Вирусный титр определяется заражения TNF-лечение, ВИЧ-1 положительных клеточной линии куртка, J1.1 7. Клетки культивировали в 96 ячейках на уровне 2,5 х 10 ⁵ клеток на мл (100 мл общего объема), а также инфицированы 100 мл последовательно разбавлены VNL-GFP-РРЭ-SA в течение недели. Титр (TCID50) частицы оценивалась путем подсчета GFP положительные скважин по методу Рида и Мюнх 8.

3. Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA

Установка: человеческий Т клеток CD4 линии, CEM-SS, впервые инфицированных ВИЧ-1. Через 48 часа после инфекции, клетки superinfected с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA. После суперинфекции в течение еще двух дней, GFP-положительных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. В качестве контроля, ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клетки одинаково инфицированы VNL-GFP-РРЭ-SA. Только ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клетки породили GFP-положительных клеток, но не ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток.

Порядок действий:

1. За два часа до инфекции, добавьте polybrane до конечной концентрации 4 мг / мл. Граф клеток и принимать по 2 х 10 ^{5 клеток} для каждой инфекции. Инфицировать клетки с 200 нг (p24) ВИЧ-1 _NL4-3 в течение 2 часов.
2. Стиральная клеток центрифуге при 300 мкг в течение 10 минут, ресуспендируютклетки в 2 х 10 ^{5 клеток} / мл и культуры при 37 ° С в течение 48 часов.
3. Граф клеток и принимать по 2 х 10 ⁵ клеток на инфекцию VNL-GFP-РРЭ-SA. Добавить 100 мл VNL-GFP-РРЭ-SA и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. Вымойте клетки и ресуспендируют в 2 х 10 ^{5 клеток} / мл.
4. Выполнить анализ проточной цитометрии в 48 часа после суперинфекции. Зараженные клетки осаждали и ресуспендировали в 500 мл 1% paraformaldehede, инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем анализировали на анализаторе FACScan (Becton Дикенсон).

4. Представитель Результаты

Если эксперименты успешно, значительное население GFP будет обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клеток потока цитометр, тогда как в контрольной, GFP-положительных клеток, не будет обнаружена ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток.

Если эксперименты успешно, Rev-зависимый лентивирусов вектор, VNL-GFP-РРЭ-SA, позволит весьма специфической детекции репликации ВИЧ в живую клетку населения, посредством измерения зеленая флуоресценция белка (GFP) выражении. В этом примере собрано CEM-SS клетки окрашивали РЕ-меченого крысиного моноклонального антитела против CD24 мыши, ЧСА, а затем анализировали на проточном цитометре для АСП и GFP выражения.

Рисунок 1. Как показано здесь, значительное население GFP был обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных клеток superinfected с VNL-GFP-РРЭ-SA (рис. 1в). В противоположность этому, GFP-положительных клеток не были обнаружены ни в HIV-1 неинфицированных CEM-SS клеток без лентивирусов суперинфекции (рис. 1а) или ВИЧ-1 незараженных клеток с лентивирусов суперинфекции (рис. 1b).

Обсуждение

Как и в ранее разработанных Тат-зависимых векторов выражения, система Rev, описанный здесь, эксплуатация процесс эволюционировал ВИЧ. Включение Rev-зависимость оказывает LTR основе вектора экспрессии в значительной степени зависит от наличия репликации ВИЧ. Применение этого вектора, как сообщили здесь, ВИЧ-зависимых репортер вирус, предлагает новый новый подход для выявления ВИЧ-положительных клеток. Вектор позволяет изучение живых клетках, может выразить любой ген для основных или клинических экспериментов, и, как псевдо-типизированных лентивирус имеет доступ к большинству типов клеток и тканей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet
37°C 5%CO2 incubator
Flow cytometer		FACSCalibur
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allega®6KR
4°C regrigerator
-20°C refrigerator
-80°C refrigerator
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer® AutoT4
HEK293T cell line	National Institutes of Health
CEM-SS cell line	National Institutes of Health
Jurkat cell line J1.1	National Institutes of Health
DMEM	Invitrogen	11965-118
RPMI 1640	Invitrogen	21870
HI FBS	Invitrogen	10438-018
HIV-1NL4-3			prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE			copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA			Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2			provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)	Invitrogen	11344-041
2M CaCl2 buffer	Invitrogen	S-013-154-10
1% paraformaldehy	Sigma-Aldrich	158127
Bleach
50ml Falcon tubes	BD Biosciences	358206
5ml round bottom tubes	BD Biosciences	352063
0.45μM Millipore filter	EMD Millipore	SLHA033SS
0.20μM Millipore filter	EMD Millipore	SLFG85000
100mm Petri-dish	Sigma-Aldrich	CLS430588
Size-exclusion column (100,000MW cut off)	Sartorius AG	VS2041
2ml frozen tube	Axygen Scientific	SCT-200
96-well plate	BD Biosciences	353227
1.7mL Microcentrifuge Tube	Axygen Scientific	MCT- 175-C