Индукция и клинической Подсчет очков Хронический рецидивирующий-экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Резюме

Это видео демонстрирует индукции и клинических озвучивание животной модели рассеянного склероза: хронический рецидивирующий-экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в DA крыс. Заболеваний, вызванных иммунизации крыс с эмульсию, содержащую все крысы спинного мозга и полного адъюванта Фрейнда, представляет клинические признаки напоминающие человеческие болезни.

Аннотация

Рассеянный склероз (РС) является хроническим воспалительным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), который часто поражает молодых людей. Она характеризуется демиелинизации и глиальных пугать в районах распространены в головном и спинном мозге. Эти повреждения изменить нервной проводимости и вызывать отключение неврологические дефициты, которые меняются в зависимости от расположения демиелинизированные бляшек в центральной нервной системе (например, парапарез, паралич, слепота, недержание мочи).

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой модель для РС. EAE была впервые индуцированных случайно у людей во время вакцинации против бешенства, используя вирусы, выращенные на кролика спинного мозга. Остатки спинного вводили инактивированные вирусы индуцированных поражение ЦНС. После этих наблюдений, первая модель EAE была описана в не-человеческое приматов, иммунизированных ЦНС гомогената по рекам и Schwenther в 1935 году. EAE с тех пор была сгенерирована за разнообразие видов и могут следовать разные курсы в зависимости от видов / напряжения и иммунизации антиген используется. Например, Льюис иммунизации крыс основному белку миелина в эмульсии с адъювантной вызывает острые модель EAE, в то время как тот же антиген вызывает хроническое заболевание у морских свинок.

Модель EAE, описанный здесь, индуцированные иммунизацией против крыс DA DA спинного мозга крыс в эмульсии в полном адъюванте Фрейнда. Крысы развивать восходящий вялый паралич в течение 7-14 дней после иммунизации. Клинические признаки следуют ремиттирующего курс в течение нескольких недель. Патология показывает большой иммунной проникает в ЦНС и демиелинизации бляшек. Особые соображения по уходу за животными с EAE описаны в конце видео.

протокол

Индукция и мониторинга хронического рецидивирующего-EAE

Эмульсия смеси 1:1 антигена в водный раствор добавляется дополнен полного адъюванта Фрейнда. Это очень важно, чтобы добавить антигена адъювантной а не наоборот!

Существует большое количество отходов при принятии и потребителей инъекционных эмульсии. Всегда готовьте 1,5 или 2 раза больше, чем то, что вам нужно.

Используйте автоклаве раствором, пестик, стеклянные шприцы, и мосты. Все пластики должны быть стерильными. Препарат может быть сделано на регулярной лабораторном столе.

1. Подготовка дополнен адъювантной

Взвесьте 30 мг микобактерий туберкулеза (Difco каталога # 231141) и поместите в раствор. Убедитесь в тонкий порошок, не нажимая слишком сильно, чтобы избежать нарушения бактерий. Добавьте 10 мл Фрейнда адъювантной H37Ra (Difco каталога # 231131) и перемешать. Это дополнено адъювантной теперь содержит 4 мг / мл микобактерий туберкулеза. Трансфер в трубке.

2. Подготовка спинного гомогената шнур

Сбор спинной мозг от Д. А. крыс (возраст / пол равнодушным) и хранить замороженными при температуре -80 ° C. Взвесьте замороженное спинной мозг, чтобы иметь достаточно смешать 1:1 (вес: объем) с дополнены адъюванта. Фарш спинной мозг так хорошо, как возможно с лезвием, трансфер в раствор, использованный в разделе 1, и сделать пасту с пестиком.

3. Подготовка эмульсии

1. Место дополнен полный адъювант Фрейнда в трубке. Vortex на высокой скорости. Добавить спинного мозга гомогената по капле в то время как вортексе. Когда все спинного гомогената шнур добавил, вихревые еще 5 минут. Смесь следует обратиться светло-розовый.
   
   
2. Положите эмульсии в 5 мл шприц стекла и связать его с еще 5 мл стеклянный шприц использованием моста 18G (Fisher Каталог № 14-825-17L). Отправить эмульсии из шприца в другой, пока не становится трудно (5-10 мин). Если более 5 мл эмульсии готовят, используя несколько шприцов 5 мл НЕ использовать большие шприцы.
   
   
3. Эмульсии могут быть сохранены в шприцах при 4 ° С в течение 3 недель. Я рекомендую его подготовке не менее 12 часов заранее, чтобы убедиться, что она не ломаются. Она должна оставаться толстыми, а не отдельно в 2 этапа. Цвет будет меняться в ночь на светло-желтый или бежевый.

4. Иммунизация крыс

1. Смешайте эмульсии в шприцы в течение нескольких минут и трансфер в шприц для инъекций. Inject 200 мкл подкожно у самого основания хвоста использовании игл 23G и 3 мл Луер-Лок шприцы по краткосрочным наркозом.
   
   
2. Получатели 7-9 недель самок крыс DA. Мы получаем наш крыс от Харлан-Sprague Dawley.
   
   
3. Крысы должны быть соблюдены два раза в день и весил в день. Клинические признаки, как ожидается 7-15 дней после введения эмульсии.
   

Клинические подсчета очков:

0: нет болезни

0.5: дистальной вялым хвостом

1: хромать хвост

2: умеренный парапарез, атаксия

3: умеренные парапарез, крыс поездки, время от времени

3.5: одна задняя конечность парализован, другой движется

4: полный паралич задних конечностей

5: полный паралич задних конечностей и недержание мочи

6: умирающий, затруднение дыхания, не ешьте и не пейте. Усыпить сразу.

Обсуждение

Есть несколько важных соображений, для этого протокола.

Генетика крыс DA будет немного отличаться в зависимости от заводчика они купили у. Эти различия могут увеличить или уменьшить чувствительность крыс к EAE индукции. Если крысы более восприимчивы к EAE вы хотите, чтобы уменьшить силу иммуниза?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s Adjuvant	Reagent	Fisher Scientific	DF 311-360-5	Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Reagent	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Manufactured by Difco
DA rat	Animal	Harlan Laboratories		Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B
Metal bridge - 18G	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml	Tool	BD Biosciences	309585
Needles - 20G 1 1/2	Tool	Fisher Scientific	14-826-5C