Опробование β-амилоида Токсичность использованием трансгенных С. Элеганс Модель

Резюме

Интенсивно изучал нематод червь Caenorhabditis Элеганс Может быть transgenically спроектирован, чтобы выразить человеческий β-амилоида пептида (Ар). Индуцированная экспрессия в Ар С. Элеганс Мышц приводит к быстрому, воспроизводимые фенотип паралич, который может использоваться для мониторинга лечения, которые модулируют Ар токсичности.

Аннотация

Накопление β-амилоида пептида (Ар), как правило, считается, что центральное место в индукции болезни Альцгеймера, но и соответствующий механизм (ы) токсичности по-прежнему неясны. Ар также хранение внутримышечно Включение миозит, миопатия тяжелой человека. Интенсивно изучал нематод Caenorhabditis Элеганс червя может быть transgenically спроектирован, чтобы выразить человеческие Ар. В зависимости от ткани или сроки Ар выражение, трансгенные червей может быть легко измеримы фенотипы, которые служат для чтения из Ар токсичности. Например, трансгенные червей с пан-нейронов Ар выражения имеют дефекты ассоциативно обучения (Dosanjh и др. 2009 год.), А трансгенные червей с учредительными мышц конкретное выражение показать прогрессивный, возраст-зависимых фенотип паралич (Link, 1995; Коэн и др. . 2006). Одним из наиболее полезных C. Элеганс модель использует чувствительные к температуре мутации в системе наблюдения мРНК для инженера температуры индуцибельной мышц выражение Ар трансгенов, в результате чего воспроизводимый фенотип паралич от температуры повышающую передачи (Link и соавт. 2003). Методы лечения, которые счетчик Ар токсичности в этой модели [например, выражение защитные трансгенов (Хасан и соавт. 2009) или воздействия экстракта гинкго билоба (Wu и соавт. 2006)] воспроизводимо изменять скорость паралич индуцированных температурой повышающую передачи этих трансгенных червей. Здесь мы описываем наш протокол для измерения скорости паралич в этой трансгенных C. Элеганс модели, обращая особое внимание на экспериментальных переменных, которые могут повлиять на это измерение.

протокол

1) Подготовка нематода Рост Медиа пластины для паралич анализа.

Паралич анализы выполняются на стандартных нематода рост средств массовой информации (НГО) пластин обычно используются для C. Элеганс распространения и генетики (Stiernagle, 2006).

1. Автоклав NGM раствор, содержащий NaCl, Агар и пептон в колбу и добавить соответствующее количество стерильной CaCl _2, урацил, холестерина, 1M MgSO ₄ и 1М КПО _4. Алиготе 10 мл жидкости NGM в каждую 60 мм х 15 мм чашки Петри. Разрешить NGM закрепить на ночь при комнатной температуре.
2. Если тестирование на эффекты соединений / экстракты, экстракт аликвоту на каждую тарелку и использовать распределитель, чтобы равномерно распределить экстракт по поверхности пластины. Разрешить экстракт для высыхания на ночь при комнатной температуре. Объемы более 1 мл, потребуется больше времени, чтобы высохнуть.
3. Пятно каждую тарелку с 250 мкл Е. палочки штамма OP5O выращивают в LB СМИ на ночь для оптической плотности 0.4-0.6. Разрешить бактерий для высыхания на ночь при комнатной температуре.

Соответствующие переменные

Возраст пластин имеет значительное влияние на паралич анализа, как пожилые пластины, как правило, высыхают. Использование пластин заливается в течение одной недели паралич анализа. Для идеальных результатов, залить пластин 3-4 дня до начала синхронной популяции червя [см. (2) ниже]. Для любого эксперимента, используют только пластины налил из той же партии.

Изменение размера газона (например, пятнистых против распространения) и / или тип бактерий также изменить поведение червей. Паралич анализы могут быть выполнены с использованием альтернативных Е. штаммов в качестве источника пищи (например, HT115 напряжение, используемые в кормлении RNAi эксперименты), но это может измениться кинетика паралич, что требует соответствующего внутреннего контроля.

2) Подготовка Возраст-синхронную населения Worm

Штамм CL4176 (SMG-1 (cc546 ^ц) I; dvIs27 [мио-3 / Ар minigene + РОЛ-6 (su1006) маркерный ген] X наиболее часто используется для опробования Ар-индуцированной паралич Этот штамм и другие трансгенные модели доступны. для академических исследователей за символическую плату от Caenorhabditis генетический центр (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Для обеспечения максимального возраста синхронность контрольной популяции желательно начать с синхронизированной родительского поколения. За неделю до начала паралича анализа испытаний населения, использование платины выбора червь для передачи 20-30 беременных взрослых на несколько 10 см NGM пластины распространяются с OP50 за 2 часа яйцо лежало на уровне 16 ° С (температура разрешительной CL4176 ). Удалить беременных взрослых и позволяют потомства расти в течение 7 дней, и к этому времени они будут "второй день" беременных взрослых.
2. (День 1) второй день беременной взрослых используются для приготовления возраст-синхронную населения тест. Для каждой экспериментальной состояние объекта для создания трех экземплярах чашки, содержащие 50-75 лет-синхронную червей. Использование палитры червь платины, передача 10-12 дня 2 взрослых беременных на 60 мм (10 мл объема) NGM пластины с пятнами OP50. Разрешить червей, чтобы отложить яйца на 16 ° С в течение 2 часов, затем обрывать взрослых и позволяют яйца люк и расти при 16 ° C. В этот момент лучше всего иметь кого-то, кто не будет забил пластины код них, так бомбардиром будет закрывать глаза на экспериментальных условиях.

Соответствующие переменные

Стадии эмбрионального развития, когда яиц (~ 26-клеточной стадии для дикого типа червей при оптимальных условиях) является функцией от взрослого возраста и питания. Если беременная взрослые используют для приготовления теста населения старше или морили голодом, позже яйца этапе будет проложена, снижение возраста синхронность населения и воспроизводимость паралич кинетики. Очень важно, чем моно-безбактериальный (т. е. только OP50 бактерий) культур используются (микробиологические загрязнения может серьезно повлиять на результаты анализа), а самая высокая воспроизводимость, если трех экземплярах пластины имеют схожие количество червей.

3) Трансгенные Индукция и паралич Пробирной

1. (День 3) повышающую передачи пластин до 25 ° С через 48 часов после окончания синхронной яйцо лежало; черви должны быть на третьем личиночной стадии (L3). Плиты должны быть организованы без укладки в 25 ° С инкубатор, чтобы все пластин достигает 25 ° C, в то же время.
2. (День 4) Начало забив параличу червей (штамм CL4176) на 18-20 часов после начала повышающую передачи. На данный момент, все черви среди населения должна была достигнуть четвертой личиночной (L4) стадии. Продолжить забив в двух-часовой шагом, пока все черви на каждой из пластин парализована. По неизвестным причинам, паралич даже не по всей длине тела: голова регион последняя часть червя прекратить движение. Таким образом, соORMs которые в последнее время начаты паралич не может перевести через тарелку, но может двигаться головы, что позволит устранить бактерии вокруг переднего и оставляя "гало" очищенной бактерий. Эти черви неизменно становятся полностью парализована, и, следовательно, черви с ореолы классифицируются как парализованный. Некоторые черви не будет иметь ореолов, но и не показывают спонтанное движение, это проверено подталкивания с червем выбора. Если ткнул червь не может пройти полное волн тела на подталкивание, он также забил, как парализованный. Для эффективного скоринга, легче всего двигаться парализованным червей незапятнанным сектора тарелку так, чтобы они не будут непреднамеренно rescored следующего периода оценки. (Это также позволяет неправильной категории червей для демонстрации движения, что позволяет забив коррекция).
3. Для создания паралич кривой, в каждый момент времени доля червей на каждой пластине, которые не были парализованы преобразуется в процентах, и средний процент "unparalyzed" откладывается на время от повышающую передачи посвящения. (Обоснование для построения таким образом, что результирующая кривая формально аналогична кривой выживаемости, и таким образом могут быть проанализированы с использованием стандартных непараметрической статистики выживания.)

Соответствующие переменные

Повышающую передачи трансгенных червей myo-3/Aβ должно произойти, прежде чем они достигнут середины L4 почву для паралича, чтобы быть начаты, как мио-3 промоутер связано с развитием регулируется, и значительно сократил выражение в конце L4 или взрослых червей. Аналогичным образом, выражение этого трансгенов блокируется, если червей начинает не хватать, поэтому очень важно, чтобы черви сытых течение всего эксперимента. Мы никогда не наблюдали парализована червь для восстановления в любых условиях, а после 12-16 ч повышающую передачи, все CL4176 червей парализует, даже если они downshifted до 16 ° С. В CL4176 напряжение, достаточное регуляция экспрессии трансгена, чтобы вызвать паралич может произойти при более низких температурах (например, 20-25 ° С), хотя сроки паралича будут изменены. Паралич ставка зависит от конкретного штамма использовали трансгенных (мы построили myo-3/Aβ штаммы с быстрее и более медленными темпами, чем CL4176), так и с альтернативными штаммов забил окно может нуждаться в корректировке.

4) Результаты представитель

Показанный на рисунке 1 представлена ​​зависимость паралича кривой CL4176, как необработанные и подвергаются 6,27 мМ кофеина (конечная концентрация в пластине НГО). Эта процедура приводит к высокой статистически значимой задержкой в ​​паралич примерно 4 часа, которые мы интерпретируем как свидетельствует о подавлении Ар токсичности в этой модели. Показанный на рисунке 2, независимый эксперимент опробование эффекты cafestol, другое соединение содержится в кофе. Этот участок является типичным для лечения, которые не влияют Ар токсичности. Обратите внимание, что в обоих экспериментах около половины необработанных CL4176 население парализовано на 24 часа в сутки, и паралич завершена на 28 час. Это типичные сроки паралич управления CL4176 населения. Значительные отклонения от этого времени свидетельствуют о изменили условия окружающей среды или спонтанное удаление трансгенов экземпляров. (CL4176 содержит хромосомно интегрированных трансгенных массив с несколькими копиями myo-3/Aβ трансгена. Хотя это трансгенные массив, как правило, достаточно стабилен, любое распространение деформации при температуре> 16 ° C подберут для редких червей, которые прошли спонтанное удаление трансгенов, в результате чего в вариантах, которые будут иметь снижение Ар выражения и медленные результаты паралич.)

Рисунок 1. Паралич кривой напряжение CL4176 червей неочищенных или подвергается 6,27 мМ кофеина (Sigma). Указано время от начала температуры повышающую передачи. Планки погрешностей = SEM

Рисунок 2. Паралич кривой CL4176 червей воздействию 0,48 мм cafestol (Sigma). Баров Ошибка = SEM

Обсуждение

Протокол мы описали могут быть эффективно использованы для анализа эффектов соединений на Ар токсичности. Опубликованные примеры включают эффекты Гинкго билоба трехсторонним (Wu и соавт. 2006) и резерпин (Арья и соавт. 2009). Соединения, которые были защитными против Ар токсичности в других системах, также было показано, что защитное в этой модели (например, мемантин, наши неопубликованные результаты). Важным обоснованием для создания этой модели является то, что хорошо развитая генетические и молекулярные инструменты, доступные в C. Элеганс могут быть использованы для исследования механизмов Ар токсичности. Таким образом, эффекты специфических мутаций на Ар токсичности могут быть проанализированы (например, эффект снижения инсулиноподобный сигнализации путем введения DAF-2 с потерей функции мутации, Флорес-МакКлюр и соавт. 2007), и эта модель также может быть использована для изучения влияния на выражение трансгены (Фонте и соавт. 2008). В последнее время мы широко использовали эту модель для изучения воздействия на токсичность одного аминокислотных замен в Ар (неопубликованные данные).

Трансгенные модели, описанной здесь анализы эффект острого Ар выражение мышечной функции клетки. Во время паралича мышечных клеток и их саркомера не повреждены; паралич фенотип не является результатом мышечного гибели клеток. Однако, после паралича (~ 48 часов после первоначального повышающую передачи) существует распад целостности мышц и возможной гибели червей. Мы не исследовали этот эффект ниже по течению от Ар выражение или использовали его в качестве маркера токсичности.

Выражение индуцибельной Ар модели, описанной здесь не подходит для исследования лечения, которые модулируют β-амилоида образованию как таковому. Хотя трансгенные червей с учредительными форма выражения Ар легко обнаружить отложения амилоида (Фэй и др., 1998;.. Ссылка и др. 2001), трансгенные червей с индуцибельной выражение Ар редко амилоидных отложений и паралич фенотип появляется независимо от амилоида (Drake и соавт. 2003). Наши результаты согласуются с мнением, что острая токсичность индуцированных Ар выражение результатов накопления растворимых олигомерных Ар, не амилоидных отложений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагенты	Quantity/2L	Компания / Catalogue #	Комментарии
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Агар	40г	Sigma-Aldrich / A7002
Пептон	5г	Sigma-Aldrich / P0556
DDH 2 O	2L
1М CaCl 2	2 мл		147.02mg/mL в DDH 2 O
Урацил	2 мл		2mg/mL в DDH 2 O
Холестерин	2 мл		5mg/mL в этаноле (не автоклав)
1M MgSO 4	2 мл		246.5mg/mL в DDH 2 O
1M КПО 4	50 мл		98mg KH 2 PO 4. Мл, 48mg K2HPO4/mL в DDH 2 O, рН
Коническая колба Эрленмейера		VWR