В естественных условиях ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) внутрисосудистого молекулярной визуализации воспалительных Зубной налет, мультимодальный подход к изображений атеросклероза

Резюме

Мы подробно нового ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) катетер для 2-мерных внутрисосудистого молекулярной визуализации налета биологии В естественных условиях. Катетер NIRF может визуализировать ключевые биологические процессы, такие как воспаление, сообщая о наличии зубного налета-заядлый активируемые и целевых флуорохромами НДК. Катетер использует клинические требования и силовой, и предназначена для применения в человеческой коронарных артерий. Следующие исследования исследование описывает смешанные стратегии визуализации, которая использует новые В естественных условиях Внутрисосудистого NIRF катетер, чтобы изображение и количественно воспалительные бляшки в протеолитически активной воспаленными atheromata кролика.

Аннотация

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.¹

Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.⁴ While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.² The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.

Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.^2,5

Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes¹⁰, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis⁸. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.^3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology⁶, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.¹⁰ Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.

In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,⁶ is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.^11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

протокол

В модели животных онлайне: Поколение экспериментальной Атеросклероз аортоподвздошный

1) Базовый Ангиография и воздушных шаров Денудация

1. До получения базовых ангиографии и воздушный шар денудации, Новой Зеландии белый кролик питается высокий уровень холестерина (1%) диета в течение 1 недели. Это животное используется для поступательного отношение, как 1) аорто-iliacs судов в кролики же калибра, как человеческие коронарных артерий (2,5 3,5 мм) и 2) гиперлипидемией, воздушный шар травмы модель порождает воспаленной атеросклероза подшипников аналогичного воспалительных клеток (макрофагов ) и молекул (катепсины), как в человека атеросклероза.
2. После холестерина кормления животных под наркозом с пропофола и кетамина. Один дюйм вентральный вырез шеи средней линии осуществляется с помощью использования размера 15-лезвие скальпеля. Использование методов тупой диссекции, мышц под фасции на правой стороне трахеи подвергается. Левая мышца sternocephalicus отделяется вдоль ее соединительной ткани соединения, а правой общей сонной артерии подвергается. Артерии отделяется от блуждающего нерва. Проксимального и дистального петли шва располагаются на артерии, чтобы обеспечить опровержение и окклюзии. От 1 до 2 мм скошенные arteriotomy производится через который 5 французских (наружный диаметр 1.67mm) сосудистой оболочки вставляется и гепарин (1000μ/mL, ~ 150units/kg) вводят внутри-arterially через оболочку.
3. Контрастность красителя (Ультравист) затем вводят (от 1 до 2 мл) в течение 2 Второй период для получения контроля ангиограмма дистальной аорты и оба подвздошных артерий.
4. Iliofemoral артерий и аорты, затем ранения в результате денудации эндотелия. Используя стандартные методы рентгеноскопии, 3FR катетер Фогарти эмболэктомия помещается в дистальной iliofemoral артерии и надуваются от 0,3 до 0,5 мл контраста (50% contrast/50% раствора) или по воздуху. Катетер затем отозвано проксимально в наполненном состоянии расстояние вдоль правой подвздошной и дистальной аорты до взлета левой почечной артерии. После шар денудации, ангиография повторяется в документе судна проходимости. После ангиографии, все катетеры и оболочки удаляются и проксимальных правой общей сонной артерии лигируют, мышцы и фасции зашивается с 4 / 0 рассасывающиеся нити, а разрез кожи закрыты с 4 / 0, не рассасывающиеся нити.
5. Животное затем позволили восстановить с администрацией одну дозу антибиотиков (Cephazolin, 0,5 г IM). Боль лекарства в том числе 0,01 мг / кг бупренорфина IM (два раза в день по мере необходимости). Животные затем продолжил на 1% холестерина в течение 4 недель после шар денудации. На неделе 5, животные перешли на 0,3% холестерина диету.

Комплексная мультимодальных изображений Кролика Atheromata

2) Маркировка протеолитически активной воспаленными доска использованием инъекционного наносенсор, ангиография, внутрисосудистое ультразвуковое исследование (ВСУЗИ), и в естественных условиях внутрисосудистого NIRF изображений Кролик атеромы

1. Восемь недель после травмы воздушный шар, и за 24 часа до обработки изображений, кролика вводят внутривенно 500 нмоль / кг Prosense/VM110 (PerkinElmer) через ухо вены.
2. Двадцать четыре часа после инъекции, животных под наркозом и артериальной доступ получен с помощью левой общей сонной артерии (см. шаг 1.2). Внутриартериального гепарин вводят (150 ЕД / кг). Базовый ангиографии получается, что и выше.
3. ВСУЗИ катетер загружается на клинические коронарной артерии способны 0,014 дюйм проволоки и вставляется в ножны. Использование флуороскопа, рентгеноконтрастный кончик провода расположены дистально в правой подвздошной артерии. ВСУЗИ катетер затем продвинулся в проксимальных подвздошной артерии с использованием стандартной техники клинических монорельсовая дорога.
4. 100 мм откат по инициативе и изображения записываются. Продольные реконструкция судна получается и просвета доска выявлено.
5. Катетер NIRF ^11,12 загружается на 0,014 дюйм проволоки (монорельсовые системы), и катетер осторожно вставляется в ножны и обработки изображений головка располагается дистально в правой подвздошной артерии.
6. Несколько автоматизированных откатах (1 мм / с продольными откат, 30 выстрелов в минуту) выполняются и флуоресценции сигналов в пределах зоны атеросклероза отмечаются. Изображения записываются и дальнейшей обработки с соответствующим масштабированием и оконной на основе спектра сигнала достигается.

3) Эвтаназия и изоляции бывших естественных аорто-подвздошных ткани

1. Эвтаназия осуществляется с 1cc эвтаназии агента (решение 390mg натрия фенобарбитала и фенитоина 50 мг натрия), внутривенно, одной инъекции.
2. Артериального дерева озарен 0,9% физиологического раствора до нижней полой вены ясно крови. Атеросклеротических артерий аорты и подвздошных были выявлены и расчлененных свободным от окружающих тканей. Кроме того, малые 2 х 2 см куски Liверсии, почки, селезенка и сердце, также получены.
3. Экс естественных изображений с NIRF внутрисосудистого катетера NIRF изображения можно сделать на данном этапе. Судно удлиненные и катетер NIRF повторно вставлен в проксимальной аорты до визуализации головка располагается в правой подвздошной артерии или бифуркации. Несколько автоматизированных откатах выполняются как указано выше (см. п. 2.6).

4) Ex естественных условиях флуоресцентного отражения Imaging (ПТ) расчлененного аорты и подвздошных артерий

1. Расчлененный ткани помещают в 10-20 мл физиологического раствора и транспортируется для анализа ПТ (Kodak Image станции 4000мм Pro, Carestream Health, Inc.)
2. Аорты, сосудов подвздошной вытянуты приблизить реального времени длины и изображения, полученные при разных длинах волн [белый свет, зеленый флуоресцентный канал (бывший 495 нм, ет 515 нм), Cy5 (бывший 565 нм, ет 670 нм) и Cy7 (экс 650 нм, ет 760 нм)] каналов. Серия экспозиций используются для каждой длины волны (0.1-30сек) и полученные изображения экспортируются как DICOM или 16-битных TIFF-файлах немасштабированный для дальнейшего анализа. Как положительный и отрицательный контроль, органы (печень, селезенка, почки и сердце) изображаются на аналогичных каналов и экспозиции.
3. Районы повышенного сигнала в ближней ИК-каналу (780 +) отмечены в атеросклеротических артериях.

5) Ткань для вложения Секционирование и иммуногистохимического анализа

1. Области нормального (не поврежденных тканей, т.е. левая подвздошной артерии) и области зубного налета были выявлены и небольшие кольца 5-10 мм тканей, внедренных в октябре (оптимальная температура резка) средства массовой информации. Блоки хранятся при температуре -80 С до секционирования.
2. Стандартные методы секционирования и иммуногистохимического анализа выполняются. Гематоксилином и эозином пятно, Рам-11 и B Катепсин окрашивания выполняются.

Анализ и интеграция мультимодальных изображений (ангиография, ВСУЗИ, NIRF и ПТ)

6) Обработка NIRF и ПТ изображений

1. DICOM-файлов, содержащих изображения данных из NIRF и ЛИИ (приняты на ближней инфракрасной области 780 нм канал) откатах, обрабатываются с использованием MATLAB и Osirix программного обеспечения, соответственно. Правильное окон для отображения полного спектра интенсивности сигнала достигается. Заключительные экспорта изображений в виде файлов TIFF.
2. Файлы импортируются в стандартное программное обеспечение для обработки изображений (основной могут быть использованы). Изображения выравниваются на основе опорных точек (например, позвонки на ангиографию, подвздошных бифуркации, и почечной артерии). Области нормальной судна и доска определены.
3. Регионы интереса (ROI) вручную прослеживается (для нормальной ткани и области зубного налета) и средняя интенсивность сигнала приобретаются использованием MATLAB Osirix и, соответственно, для ПТ и NIRF изображений. Для руководства соответствующих отслеживание, продольные ВСУЗИ образ судно используется и определение нормальной судна и доска легко идентифицируются.
4. Target-на фон (TBR) нормативы рассчитаны на доску зон.

Представитель Результаты:

По завершении выше протокола, мы можем выявить и охарактеризовать областях расширенной деятельности протеазы катепсина при воспалительных доска в аорте и подвздошных сосудов. Инъекция активируемые наносенсор (Prosense/VM110) позволяет определить протеолитически активной бляшки. Они появляются в виде ярких или сигнал интенсивной зон при использовании ПТ отображаемого в ближнем инфракрасном канале (750 нм). NIRF откатах коррелируют с повышенной интенсивностью сигнала на ПТ и выравнивания с ВСУЗИ, которые позволяют анатомические регистрации сигналов NIRF. Расчетная доска TBR, полученные от ПТ и NIRF были сходными (см. Рисунок 3: среднее NIRF TBR 4.2, означает пт TBR 2.9). Иммуногистохимический анализ ярких доска подтверждает интенсивное присутствие RAM-11 и B Катепсин деятельности в области зубного налета (данные не приведены).

Рисунок 1. Схема Катетер 2D NIRF Для расширения клинического потенциала 1D NIRF зондирования подход ^6, мы построили новый 2-D NIRF-катетер для внутрисосудистого изображений. ^11,12 заказ катетер состоит из оптического волокна (125 мкм диаметром размещалась в полиэтиленовой трубы: 2.9F), который освещает использованием 750 нм лазерный источник возбуждения. Лазерный луч света под углом 90 градусов относительно оси волокна. Система использует два автоматизированных двигателей (вращательное и поступательное), чтобы дать сопутствующей 360 изображений степени и продольных откат получить истинное 2D-изображений. Изображения, используемые с разрешения ссылку 11.

Рисунок 2. Схема демонстрирует протеазы-опосредованной активации наносенсор, Prosense/VM110. Изображение используется с разрешения ссылки 10.

Рисунок 3. В естественных условиях и бывших естественных Налет TBRs (цель-в фоновый коэффициентов)

Обсуждение

Воспаление высокого риска и уязвимых бляшек, вероятно, ответственны за большинство инфарктов миокарда. Выявления таких бляшек до появления симптомов имеет важное клиническое значение как в прогнозировании исходов и руководящие медикаментозной терапии. Обычные коронарных артерий фо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prosense 750	Visen Medical	VM110	500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium	APP Pharmaceuticals	401586D
Cephazolin	NovaPlus	46015683
Lidocaine HCL 2%	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01
Buprenorphine	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10
Ketamine	Hospira Inc.	NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1%	Research Diets	C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3%	Research Diets	C30255