Высокое разрешение Волоконно-оптические Microendoscopy для На месте Сотовые изображений

Резюме

Во многих биологических и клинических ситуациях целесообразно изучать клеточные процессы, как они развиваются на родном микроокружения. Здесь мы опишем сборки и использования недорогих волоконно-оптического микроскопа, который может обеспечить реальные изображения времени в культуре клеток, исследования на животных и клинических исследований пациента.

Аннотация

Многие биологические и клинические исследования требуют продольного исследования и анализа морфологии и функции с сотового разрешение уровне. Традиционно, многочисленные эксперименты работать параллельно, с отдельными образцами удалены из исследования в последовательных моментов времени для оценки с помощью световой микроскопии. Несколько прижизненной методы были разработаны, с конфокальной, многофотонной, и второй гармоники микроскопии всех демонстрируя свои способности, которые будут использоваться для работы с изображениями на месте ^1. С помощью этих систем, однако, необходимая инфраструктура является сложным и дорогим, включая лазерное сканирование системы и комплексный источников света. Здесь мы приводим протокол для проектирования и сборки с высоким разрешением microendoscope, которые могут быть построены в день, используя вне готовых компонентов для по 5000 долларов США. Платформа обеспечивает гибкость в плане разрешения изображения, поля-обзора, а также рабочей длины волны, и мы рассмотрим, как эти параметры могут быть легко изменены в соответствии конкретные потребности конечных пользователей.

Мы и другие исследовали использование высокого разрешения microendoscope (HRME) в пробирке в культуре клеток ^2-5, вырезали в ⁶ и живых животных тканях ^2,5, а в тканях человека в естественных ^2,7. Пользователи сообщили, использование нескольких различных флуоресцентных контрастных средств, в том числе профлавина ^2-4, benzoporphyrin производной monoacid кольцо (BPD-MA) ^5, и fluoroscein ^6,7, и все они получили полное или исследуемого одобрение FDA для использования в человеке. Высокое разрешение microendoscopy, в виде описанных здесь, может обратиться к широкому кругу исследователей, работающих в области фундаментальных и клинических наук. Техника предлагает эффективный и экономичный подход, который дополняет традиционные настольные микроскопии, позволяя пользователю выполнять с высоким разрешением, продольные изображения на месте.

протокол

1. Microendoscope Ассамблеи

С высоким разрешением microendoscope описано здесь (рис. 1а) следует рассматривать в качестве базовой конфигурации с несколькими вариантами возможных в сборке и применению. Мы подробно описывать здесь воплощение платформу, которая предназначена для использования с профлавина как флуоресцентный агент контрастности. Профлавина яркое пятно с ядерным пик поглощения и излучения длиной волны 445 нм и 515 нм соответственно. Использование других контрастных средств потребуется пользователю выбрать возбуждения, испускания и дихроичных фильтров надлежащим образом. Некоторые элементы с высоким разрешением microendoscope носят общий характер и могут быть получены от разных производителей. Например, оптико-механические компоненты позиционирования можно получить Thorlabs, Ньюпорт, Линос среди других. Компактные камеры CCD доступны от компаний, в том числе Point Grey исследований, Prosilica и Retiga; чувствительность камеры должны быть выбраны с учетом яркости флуорофора, которые будут использоваться, а также желаемую частоту кадров. Мощные светодиоды (LED) могут быть получены из Luxeon, Cree, Nichia и среди других. Волоконно-оптические пучки можно получить Sumitomo, Fujikura, и Шотт. При выборе компонентов для конкретного приложения, пользователь должен рассмотреть органические связи, участвующих в флуоресцентной микроскопии между флуорофора концентрации, фотообесцвечивания, освещенности, чувствительность камеры, усиления и времени экспозиции.

1. Подключите 6 "стержни клетку 1,5" стержней клетку, чтобы сформировать пару 7,5 "длинных стержней. Винт этих стержней в одном лице фальцовки зеркало. Винт 0,5" стержней в противоположной грани. Слайд клетке куба на клетку стержни, через два нижних отверстия. Винт 2 "стержней в боковой грани куба клетки (рис. 1b).
2. Прикрепите камеру к клетке табличка с помощью C-крепление к адаптеру SM1. Безопасные клетке табличку на 0,5 "стержней клетке, на одном уровне с лицом фальцовки зеркало.
3. Вставить "трубы" линзы в 3 "длинную трубку объектива и безопасный объектив с стопорного кольца. Фокусное расстояние линзы должны быть выбраны так, что ядра волоконно-оптических расслоения выборки, по крайней мере два пикселя при проецировании на камеру. Бросьте выбросов фильтр в трубку на вершине первого стопорного кольца, а также добавить еще одного кольца для обеспечения фильтр на место. Соблюдать фильтр конвенции ориентации указывает фильтр производителя. Винт объектив трубку в сторону клетке куб ближайший к ПЗС-камерой. Обратите внимание, что на рисунке 1c, этот объектив и фильтр указаны без 3 "объектив трубки для ясности.
4. Подключите камеру к компьютеру и просматривать изображения на экране. Прямая клетке сборки на удаленный объект и слайд-клетки куб по рельсам, пока изображение появляется в центре внимания. Блокировка клетке куба в этом месте. (Это простой способ обеспечения того, чтобы трубка объектив форме сфокусированное изображение в сочетании с коррекцией бесконечности объектива).
5. Вставьте дихроичных зеркал в держатель и поместите под углом 45 ° в клетке куб.
6. Винт объектив, с помощью службы управления правами SM1 резьбой и регулируемые трубки объектива, в лицо клетке куб противоположных держателю линзы трубки. Г-переводчик может быть использован вместо регулируемой трубкой объектив для облегчения фокусировки. Винт SMA разъем в клетке пластины и монтировать на стержни, примерно в рабочее расстояние объектива.
7. Горы светодиод на пластине клетку и слайд в конец 2 "стержней. Добавить объектив 0.5" объектив трубки, например, что когда эта труба ввинчивается в сторону клетки куб, он будет формировать изображение светодиодные , которая заполняет заднюю апертуру объектива. Это (Kohler освещение) конфигурация гарантирует, что проксимальная лицом волоконно-оптический пучок равномерно освещен. Добавить возбуждения фильтр для 0.5 "объектив трубы и безопасности в месте с стопорного кольца (рис. 1в).
8. Прикрепить SMA разъем для волоконно-оптических расслоения. Винт SMA подключаемых расслоения в SMA сосуд установлен на клетку стержней. Прямая дистального конца расслоения к источнику широкополосного света (люминесцентные лампы будет достаточно) и следить за изображением расслоения проксимальных лицо на ПЗС-камерой. Отрегулируйте положение объектива при помощи винтов или из клетки куб, пока изображение расслоение появляется в центре внимания. Отдельных ядер должны быть четко видны (рис. 2).

2. Ассамблея GRIN объектива

Пространственное разрешение microendoscope может быть увеличена путем присоединения микро-объектив или сборки дистального кончика расслоения. Эти оптика настроена так, что вместо размещения пучок наконечник непосредственно на ткани, кончик изображается на поверхности ткани с уменьшение масштаба, тем самым увеличивая пространственную частоту дискретизации введенные световых GUIDING ядра расслоения. Степень уменьшение масштаба соответствует увеличение пространственного разрешения, и в то же время, пропорциональное уменьшение поля-обзора. Компоненты градиента индекса (GRIN) линзы, совместимые с волоконно-оптических и доступны у GrinTech, ГЯП, Schott, среди прочих, и может быть непосредственно связан с дистального кончика расслоения.

1. Выберите GRIN объектив с необходимым увеличение и рабочее расстояние для вашего приложения. Убедитесь, что диаметр объектива превышает расслоение вы планируете работать. Мы рекомендуем, чтобы расслоение и GRIN объектив устанавливается на отдельный 3-х осевой этапов ручного позиционирования под микроскопом низкой мощности или стереоскоп для точного выравнивания до связи.
2. Место падения оптического клея (например, Норланд УФ-отверждения клея) по обе линзы или пучок лицо. Принесите из двух компонентов в контакт с помощью ручной позиционеров. Expose интерфейс к ультрафиолетовому излучению для дозы, рекомендованные производителем.
3. Чтобы защитить объектив GRIN и интерфейс связан, короткая длина алюминиевого капиллярные трубки (мелкие детали, Inc) может быть использован для приложить совместные. Слайд трубы над суставами и безопасный на месте с помощью эпоксидной смолы. Термоусадочная трубка может быть использован для завершения сборки.

3. Microendoscope изображений

1. Применение контрастного вещества для клеток или тканей для включения в образ. С профлавина (0,01% вес / в PBS), в пробирке визуализации клеток в культуре может быть выполнена краткая инкубации (<1 мин) и тщательного промывания. Изображений образцов бывших естественных тканей или тканей в естественных условиях можно следующим местным применением красителя. Поглощение профлавина в этих условиях было установлено, что почти мгновенно, с изображениями возможна в течение нескольких секунд и длится несколько минут.
2. Место волоконно-оптический пучок света в контакте с образцом для включения в образ. При визуализации клеток в культуре или бывших образцов тканей естественных условиях, мы рекомендуем установки дистального конца расслоение в безопасный прибор с ручным этапы позиционирования по осям XYZ для стабильности во время съемки.

4. Представитель Результаты:

Когда собраны правильно, microendoscope будет работать как эпи-флуоресцентного микроскопа, переданное через когерентные волоконно-оптические расслоения. Для получения оптимальных результатов обработки изображений, внимание должно быть уделено обеспечению того, чтобы три ключевых условия:

1. Проксимальных лицом расслоения должны быть отображены на ПЗС-камерой без расфокусировки, с тем чтобы добиться полного разрешения системы. На рисунке 2а, б, в демонстрации части расслоение полученную с плохой фокусировки, небольшой расфокусировки, и хороший фокус, соответственно. Оптимальные фокус находится путем корректировки осевое положение объектива относительно расслоения лицо.
2. Проксимальных лицом расслоения должны быть равномерно освещен по всей ее диаметра (поля-обзора). Как описано в протоколе текст (1.7), это достигается путем настройки освещения оптика для освещения Колер. Рис 2d показывает изображение получено, когда единый флуоресцентные освещения образца в этом предпочтительной конфигурации, с рисунком 2e демонстрируя соответствующий результат в критических освещения. В последнем случае структура светодиодной изображается на лицо расслоения, в результате появления этого нежелательного шаблон накладывается на истинной структуры образца.
3. Оба проксимальных и дистальных лица расслоения должны быть чистыми и свободными от царапин и сколов. Рис 2f демонстрирует наличие мусора прилагается к расслоению лицо, с повреждением в виде небольшого чипа в 5 часов на волокне периметру. Мусор может быть удален из пакета лица, очищая таким же образом, как и обычные волоконно-оптических разъемов, с бумажными объектива и изопропанол, или стандартный волоконно-оптические инструменты очистки. Если один конец расслоение поцарапан или расколотые, или, если пучок перерывами вдоль его длины, лицо может быть полированной плоской стандартными ручными или механическими методами полировки. Мы рекомендуем 12-15 мкм притирки бумаги для начальной грубой для ногтей, с окончательным для ногтей на 0.5-1.0 мкм бумаги.

На рис.3 демонстрирует визуализацию 1483 клеток в пробирке, после маркировки с профлавина и легкого размещения голыми расслоение на образце. На рисунке 3б демонстрирует улучшение пространственного разрешения и снижение в поле сектор обзора предоставляемые 2.5x объектив GRIN связанных с расслоением чаевые. Фильм 1 демонстрирует в естественных изображений молочной жировой ткани у мышей. Здесь, расслоение с 0,5 мм наружным диаметром (330 мкм полевых зрения), пропускали через 21-иглы и передовых в ткань. Жировые клетки хорошо видны, при движении из-за сердечного цикла проявляется в этом приобретении в 15кадров в секунду. 3, в демонстрирует визуализацию слизистой оболочки полости рта здорового человека добровольцем, на этот раз используя большее расслоение с 1,5 мм Внешний диаметр (1,4 мм полевых зрения). Во всех примерах показано, профлавина был использован в качестве ядерной маркировки флуоресцентных контрастного вещества.

Рисунок 1. Сборка с высоким разрешением microendoscope (HRME). (А) Принципиальная схема HRME системы. (Б) Ассамблеи основных оптико-механические структуры поддержки. (С) Добавление оптические элементы, светодиодной подсветкой, и ПЗС-камерой. (Г) Фотография HRME системой, упакованный в 10 "х 8" х 2,5 "корпусе.

Рисунок 2. Настройка HRME. Примеры изображений с волоконно-оптическим пучком в () фокус бедных, (б), близкий к хорошим фокусом, (в) идеальный фокус. В (г), равномерное флуоресцентные цель на дистальный конец расслоения является отображаемого под Колер (равномерная) освещения. (Е) единый флуоресцентные целевой отображаемого в критических освещения, с источником структуры видны на объекте. (Е) рыхлой ткани и клетки могут прилипать к лицу расслоения, который также подвержен незначительные повреждения на ее периферии.

Рисунок 3. Формирование изображений с помощью HRME. () 1483 клеток в пробирке, полученную с голыми расслоения (IGN-08/30) после маркировки с профлавина 0,01% (м / о). (Б) То же 1483 культуре клеток, как показано на (а), полученную с расслоением с 2.5x объектив GRIN прилагается. (С) Изображение нормального человеческого слизистой оболочки полости рта в живом организме, после местного применения профлавина 0,01% (м / о).

Фильм 1. Изображений молочных жиров площадке мыши с помощью вставки 450 мкм внешней расслоение диаметром в просвете 21-игла прошла в ткань. Профлавина 0,01% (м / о) был доставлен изображений сайта через ту же иглу до введения изображений волокна. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео

Обсуждение

С высоким разрешением microendoscopy методике, описанной здесь, предоставляет исследователям в базовых биомедицинских и клинических исследований районах с гибкой, надежной и экономически эффективным методом для визуализации сотовой деталь на месте. Мы описали протокол для сборки системы визуализации и продемонстрировал его применение в культуре клеток в пробирке, и в животноводстве, и тканей человека в естественных условиях. В то время как визуализация результатов, представленных здесь используется профлавина как люминесцентные контрастного вещества, другие группы продемонстрировали версии системы со светодиодной подсветкой длин волн и фильтров выбраны в соответствии возбуждение / излучение спектров других красителей ^5-7.

Разрешение и поля-обзора изначально определяется ядро-ядро расстояния и обработки изображений диаметром волоконно-оптических расслоения. Мы использовали пучки с примерно 4 мкм ядро-ядерных интервал, а также изображения диаметром 330 мкм (фильм 1), 720 мкм (рис. 2, рис.3, б), и 1400 мкм (рис. 3в). Меньше пучки могут быть переданы через узкие иглы датчика и значительно более гибким, чем больше волокон. Мы и другие ⁸ имеют, в некоторых случаях отмечается появление аутофлюоресценция выбросы от расслоения себя. При попытке возбудить флуорофоров в УФ-волны, или собирать излучение в красной области спектра, следует обратить внимание на уровень расслоения аутофлюоресценция способствует общему измеряемого сигнала.

Хотя большинство из высокого разрешения работы microendoscopy сообщает актуальную использовал голое расслоение, дополнительное увеличение может быть обеспечена путем использования GRIN линз связан с дистального конца. GRIN линзы предлагает простой и экономичный способ увеличения пространственного разрешения, хотя их чувствительность к оптических аберраций и ограниченные Н. получило широкое признание. Если производительность GRIN линз недостаточно для конкретного приложения, гибридные GRIN / сферические объективы ⁹ или миниатюрные сборки объектива ^10-11 могут быть использованы.

С высоким разрешением microendoscope описанные здесь по существу работает как широкого поля эпи-флуоресцентного микроскопа, поэтому без оптического секционирования (как в конфокальной микроскопии или нелинейная) и следовало ожидать. По нашему опыту, с использованием 455 нм возбуждающего света и актуальные профлавина качестве контрастного вещества, свет в основном собраны из глубине, соответствующей несколько слоев клеток.

Этот протокол должен дать возможность читателю собрать с высоким разрешением microendoscope на настольный, с компактном корпусе 10 "х 8". При необходимости система может быть заключен в коробку и электрические компоненты (светодиоды и камеры) на питание от аккумулятора (рис. 1г). Многие компактные камеры могут получать питание от IEEE-1394 (Firewire) и USB-портов компьютера.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)