Органотипической культуре Кусочек GFP-экспрессирующих эмбрионов мыши для реального времени изображений периферической нервной вырост

Резюме

Мы представляем способ получения органотипической ломтиками середине беременности эмбрионов мыши для выращивания и замедленная съемка периферического отросток нерва.

Аннотация

Для многих целей, культивирование естественных мыши бывший эмбрионов в качестве органотипической ломтиками желательно. Например, мы используем линию трансгенных мышей (tauGFP), в котором расширенная версия зеленого флуоресцентного белка (EGFP) исключительно экспрессируется во всех нейронов развивающихся центральной и периферической нервной системы ^1, что позволяет возможность как фильм иннервации передних конечностей и манипулировать этим процессом с фармакологическими и генетическими методами ^2. Наиболее критичным параметром в успешном выращивании таких культур срез метод, посредством которого ломтиками готовы. После обширного тестирования различных методов, мы обнаружили, что vibratome является наилучшим устройством для среза эмбриона, что они обычно приводят к культуре, которая демонстрирует жизнеспособность в течение нескольких дней, и, самое главное, развивается в возрасте конкретным образом. Для середине беременности эмбрионы, это включает в себя нормальным следствием спинальных нервов из спинного мозга и спинной ганглий корня до своих целей на периферии и правильного определения костной и мышечной ткани.

В этой работе мы представляем метод обработки целых зародышей эмбриональных день (E) E10 в E12 на 300 - 400 мкм ломтиками для выращивания в стандартной тканевой культуры инкубатор, который может быть изучен на срок до двух дней после среза подготовки. Решающее значение для успеха такого подхода является использование vibratome резать каждый агарозном встраиваемый эмбриона. Это сопровождается выращивания ломтиками на Millicell культуры мембраны вставки помещается на небольшой объем среды, в результате чего техника культуре интерфейс. Один помете в среднем по 7 эмбрионов обычно производит не менее 14 ломтиков (2-3 ломтика передних конечностей региону в эмбрион), который немного отличается из-за возраста эмбрионов, а также толщина ломтиков. Около 80% культурных ломтиками показать нерва результат, который можно измерить througout ² периода культивирования. Представитель результаты, используя линию tauGFP мыши продемонстрировали.

протокол

Часть 1: Подготовка для нарезки и культивирования.

1. Подготовка 10-см пластин культуре ткани с нарезки среды (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5% глюкозы, 1 мМ глутамина, 2,5 мМ HEPES, рН 7,3) и 3-х см Millicell-CM 0,4-мкм культуры мембраны вставками и держать в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
2. Нагрейте 4% низкой температурой плавления агарозы в PBS в микроволновую печь и держать его при нагреве пластины так, чтобы он остался примерно на 37 ° C.
3. Заполнить 10-см бактериологические чашки Петри с PBS (140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na ₂ HPO _4, 1,8 мм KH ₂ PO ₄₎ и место на льду.
4. Настройка микротома устройство охлаждения или обеспечить, чтобы лоток буфера и охлаждающие элементы хранятся в морозильной камере предварительного охлаждения.

Часть 2: Эмбрион вложение.

1. Рассеките эмбрионов из матки и рассмотреть их с перевернутой флуоресцентного микроскопа для проверки GFP выражения.
2. Место эмбрионов на перевернутую 10-см чашку Петри и ориентировать их использования полосах ватмана, чтобы удалить чрезмерное PBS.
3. Применение агарозы на эмбрион, чтобы исправить ее в этом положении. Давайте агарозном затвердеть.
4. Ограничьте область вокруг эмбриона путем разрезания лезвие бритвы.
5. Поворот встроенного эмбриона на его другой стороне.
6. Применить дополнительные агарозы на эмбриональной ткани для того, чтобы эмбрион полностью внедрен.
7. Подготовка агарозном блоке с чистые края и смонтировать на vibratome патрон использованием Loctite 406, специальный клей похожи на "Krazy Glue».

Часть 3: нарезки процедуры.

1. Настройка предварительно охлажденном лоток буфера и охлаждающий элемент.
2. Вставьте патрон с клееные ткани и добавить 1x HBSS (Са ^{2 +-Mg 2 +-свободный} HBSS, 10 мМ HEPES буфере рН 7,3, 500 ед / мл пенициллина / стрептомицина), пока не охвачены.
3. Вставьте и закрепите precleaned (70% этанол) микротома лезвия.
4. Подготовка 350 - 450 мкм ломтиками и передача их с помощью укороченной стеклянные пипетки Пастера в пластины тканевой культуры держится на льду.
5. Используя пару щипцов, тщательно удалить из агарозы каждый кусочек и трансфер в Millicell культуры мембран. Около 4 ломтика можно выращивать на одном мембраны в 10-см культуре ткани пластины заполнены 6 мл питательной среды.
6. Инкубируйте ломтиками при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ (культуры среда: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5% глюкозы, 1 мМ глутамина, 2,5 мМ HEPES, рН 7,3). Если человек совершает покадровой визуализации серии следует иметь объем среды постоянна. В случае серии приурочен визуализации для короткого промежутка времени достаточно, чтобы оставить среде, как она есть. Для более длительных периодов культуры изменений после 12-20 часов рекомендуется.

Часть 4: изображений спинного нерва на вырост микроскопом.

1. Изображение спинномозговых нервов размещения 10-см культуре ткани пластины, содержащие мембраны Millicell культуры с ломтиками, при вертикальном флуоресцентный микроскоп.
2. Этикетка ориентации Millicell культуры мембран на столике микроскопа в положение правильно во время следующей точке изображения.
3. Изображение спинного нерва результатом использования 4-кратного (числовой апертурой [Н.] 0,1), 10x (NA 0.3), или 20x (NA 0.5) целей.

На рисунке 1 показано изображение серии изображением спинного нерва результат в течение 20 часов культуры с 4-кратным и 10-кратным целей.

Рисунок 1 изображений серии спинного нерва в результате поперечного кусочек гомозиготных эмбрионов tauGPF. * = Двигательные нейроны спинного мозга вентральной, стрелка = DRG. Спинные (D)-вентральной (V) оси срез указано. Scalebars: 200 мкм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В обширной сравнения методов для подготовки эмбриональных культур кусочек середине беременности эмбрионов мыши (E10 - E12), мы заметили, что vibratome производит без сомнения, наиболее надежные результаты в отношении как общей жизнеспособности культур и воспроизводимость шаблоны нерва резул...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS 10x	GIBCO, by Life Technologies	14180
Dissection tools	Fine Science Tools	various
L.M.P. agarose	Invitrogen	15517-022
Whatmann paper	Whatman, GE Healthcare	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-glutamine 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Vibratome	Microm International	HM 650 V
Fluorescent microscope	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM inserts	EMD Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Razor blades	Thermo Fisher Scientific, Inc.	none
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
x4 objective	Olympus Corporation	PL series
x10 objective	Olympus Corporation	UPLFL –PH series
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD camera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171