Парные Patch Clamp Recordings от Мотор-нейрон и целевые скелетных мышц в данио рерио

Резюме

Личинки данио представляют собой первые модели системы позвоночных, чтобы одновременной записи зажим патч от спинного моторных нейронов и целевых скелетных мышцах. Это видео демонстрирует микроскопических методов, используемых для определения сегментарной CaP моторных нейронов и клеток-мишеней мышц, а также методологии для записи с каждого типа клеток.

Аннотация

Личинки данио представляют собой первые модели системы позвоночных, чтобы одновременной записи зажим патч от спинного моторных нейронов и целевые мышцы. Это прямое следствие доступности обоих типах клеток и способности визуально отличить одно сегментарный CaP моторных нейронов на основе морфологии и расположения. Это видео демонстрирует микроскопических методов, используемых для выявления РПЖ моторных нейронов и клеток-мишеней мышц, а также методологии для записи с каждого типа клеток. Определение CaP моторных нейронов типа подтверждается либо красителя заполнения или биофизических функций, таких как потенциал действия сигнала и сопротивление ячейки ввода. Мотор-нейрон записи обычно длится один час позволяет долгосрочной записи с нескольких различных мышечных клеток цели. Контроль за мотор-нейрон стрельбы шаблон позволяет измерения частотной зависимости синаптической передачи в нервно-мышечном соединении. Благодаря большим размерам и квантовой низкий уровень шума при условии, целыми зажим напряжения ячейки, все унитарные события могут быть решены в мышцах. Эта функция позволяет изучить основные синаптические свойства, такие как освобождение свойства, пузырьки переработки, а также синаптической депрессии и процедур. Преимущества, предлагаемые этой подготовки в естественных условиях затмения предыдущие нервно-мышечной системы модель изучал котором мотор-нейронов, как правило, стимулируется внеклеточных электродов и мышцы являются слишком большими для всей зажим патч клетки. Данио подготовки поддается объединения электрофизиологических анализ широкого спектра подходов, включая трансгенных линий, морфолино нокдаун, фармакологическими препаратами и в естественных изображений. Эти подходы, в сочетании с ростом числа нервно-мышечные заболевания моделей предоставляемые мутант линии данио, открыть дверь для нового понимания человеческой нервно-мышечных расстройств.

протокол

1. Подготовка рыбы для парных Recordings

1. Перед началом процедуры, подготовить пять ключевых решений, которые включают в себя: Ванна Решение, Ванная Решение с Tricaine (MS222), Ванная Решение формамидом, Нейрон внутреннее решение и мышцы внутренних решений.
2. Затем собираем один личиночной данио в возрасте от 72 до 96 часов и место в ванной Решение с Tricaine. В течение одной минуты воздействия анестетика, рыба не будет реагировать на прикосновения.
3. Место рыб в верхней части пластиковой блюдо и с помощью стереомикроскопа, обезглавить с двойным лезвием края.
4. Передача рыбу камеры записи стекла покрыты sylgard и наполнен ванны решение. Закрепить на каждом конце, вставив электролитически заостренными контакты вольфрама через хорды.
5. Создать кожный лоскут возле ростральной конце рыбу с вывод, который будет обеспечивать адекватный контроль за пару тонких щипцов. Удалить вышележащих кожу, удерживая ее вблизи ростральной булавку с парой тонких щипцов. Пил медленно в каудальном направлении, чтобы удалить кожу.
6. Лечить рыбу с 3 мл ванны Решение формамидом в течение 3-5 минут, чтобы блокировать мышечные сокращения, которые могут помешать записи. Промыть 5 раз с нормальной Решение Бат. Удалите часть поверхностного слоя мышц в течение от 5 до 6 сегментов, осторожно слом со стороной вольфрама булавкой.
7. Передача рыбу прямой микроскоп расположен в клетку Фарадея, чтобы оградить электрических помех. Микроскоп оснащен фиксированным этапе, большим рабочим расстоянием 40x объективных и зум 0,5 до 4 раз. Микроскоп установлен на этапе трансляции моторизованных XY для того, чтобы двигаться подготовки между нервной и мышечной при высокой мощности. Использование дифференциального интерференционного контраста оптика помогает визуализировать нейронов.
8. Меньше 0,5 зум х, использовании широкого отверстия 15-микронной пипетки для удаления покрывающей мышцы и подвергать спинного мозга. Отрицательное давление подается через 3 см одноразовый шприц и мышечные клетки удаляются один за другим. Эта процедура повторяется в течение 5 до 6 сегментов спинного скелетных мышц. Же широкий отверстие пипетки используется также удалить два верхних слоях мышц брюшного получить целевой быстро скелетных мышцах.
9. Это завершает подготовку для парных записей и микроскоп зума увеличена до примерно 1,6.

2. Парные Записи CaP Мотор-нейронов и клеток-мишеней мышц

1. Очищается сегменты будут отсканированы, чтобы найти CaP нейронов. Каждый геми-сегмент спинного мозга содержит один большой, диаметром 10 микрон, CAP моторный нейрон. Это слеза формы сома расположена поверхностно под оболочки спинного возле хвостового конца наиболее сегментарные границы. Нейрона CaP выбран для записи и вентральных мышц цели в соседних хвостовой сегмент сканируется для проверки целостности.
2. Два электрода расположены патч для записи, одна для нейронов и второй для мышц. Верхнего электрода имеет мелкий конус для проникновения жесткой оболочки спинного и наконечник открытия около 2 мкм. Нижний электрод имеет более крутой конусом для низкого сопротивления напряжения зажим записи скелетных мышц
3. Позиция нейрона электрод под углом примерно 30 градусов, чтобы проникнуть спинного оболочки, около половины сегмента ростральнее выбранного нейрона CAP. Advance электрода использованием осевой манипулятор диск при применении нежной постоянным положительным давлением около 60 миллиметров ртутного. Как электрода прорывается оболочки, CaP нейрона может быть, перемещенных в результате перфузии от электрода, требующие корректировки фокуса.
4. Когда электрод касается РПЖ нейрона Сома положительное давление будет снято и обычно приводит к немедленному образованию уплотнения gigaohm. Однако в некоторых случаях, когда печать не в форме, становится необходимым применять нежные отрицательным давлением. После уплотнения образования, потенциал электрода регулируется до 80 мВ и применения отрицательного давления разрывает клеточную мембрану. Нейрона РПЖ характеризуется входным сопротивлением 140 до 180 мега-Ом и потенциала действия, что выбросы +40 милливольт. Это проверяется путем введения возрастающих деполяризующего шаги в соответствии с действующим зажим до потенциала действия вызвали.
5. Далее, микроскоп переехал в вентральной мышцы с использованием переводчик XY моторизованных при высокой мощности. Быстро мышечных клеток выбирается из целевой области.
6. Мышцы электрод подошел к ячейке целевой мышцы под положительным давлением, которое при попадании, формы gigaohm печатью. Электродный потенциал корректируется до -50 милливольт для инактивации натриевых каналов и при легком сосать клеточная мембрана лопнула. Падение сопротивления от 100 до 200 мега-Ом и внезапное появление большого емкостного вступления переходных сигналов.
7. Для проверкидля парных записи, мотор-нейрон деполяризованного путем постепенного больше инъекции тока, пока потенциала действия вызвали. На данный момент концевой пластинки ток должен быть вызван в мышцах. Продолжение стимуляции motorneuron на 1 герц приводит к концевой пластинки токов без сбоев. Как стимул частота увеличивается до 100 Гц концевой пластинки токов колебаться в амплитуде и пройти функциональное истощение в течение 10 секунд стимуляции.

3. Представитель Результаты

Как правило, запись нейронной стабилен в течение до одного часа, но мышечных клеток ухудшается, как это отражено как увеличение последовательного сопротивления. Когда это происходит эксперимент либо прекращено или иной мышечной клетки является патч зажаты. Все записи должны быть завершены в течение одного часа.

Рисунок 1. Записи потенциальных motorneuron действия (AP, вверху) и соответствующей мышцей концевой пластинки тока (EPC, внизу). Потенциал действия на нейрон РПЖ должна выброс +40 мВ и EPC должен вырасти в пределах 300 мкс и распад по экспоненциальному учебного времени с постоянной времени менее 1 мс.

Имя	Рецепт
Ванна решения (в мм)	134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 Глюкоза, 10 Na-HEPES, рН 7,8
Ванна Решение с Tricaine	Ванна раствор, содержащий 0,02% tricaine
Ванна Решение формамидом	Ванна раствор, содержащий 2М формамида
Нейрон внутреннее решение (в мм)	115 К-глюконат, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-АТФ, рН 7,2
Мышцы внутреннее решение (в мм)	120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, рН 7,4

Таблица 1. Solutions.

Обсуждение

Мы использовали данио парных записей (Вэнь Цзябао и Брем, 2005), главным образом для изучения процессов выпуска везикул и утилизации при высокой частоте стимуляции. Этот процесс нарушается моторика мутантов в котором нормальные синаптическую передачу под угрозу из-за точечных мутаций в ключевых синаптические компоненты. Например, мутации, которые нарушают постсинаптических рецепторов агрегатов (Ono и соавт., 2001, 2002, 2004) и синтеза пресинаптических передатчика (Wang и соавт., 2008) приводит к не-скоординированное плавание. Парные записи обеспечивают информацию, которая может определить источник функциональных дефектов, увязывая, тем самым поведение, генетики и физиологии. Теперь должно быть возможным дальнейшее анализировать процессы, лежащие синаптической передачи с помощью переходных выражение в РПЖ моторных нейронов использованием разумное промоутеров. Таким образом, доминирующим отрицательным или мутировавших генов могут быть конкретно выраженная в этих нейронов и как поведенческие и электрофизиологические последствия определены. Дополнительным преимуществом предлагаемых всю конфигурацию клеток позволяет диализа CaP сома с агентами, которые потенциально могут изменить пузырьков переработки, таких как токсины клостридий и кальция буферов. Из-за короткого расстояния между сомой и мышцы, диффузии должно происходить в пределах сроков записи. Потенциал этого препарата только начинает быть использован. Прозрачность рыбы в этом возрасте и поверхностных расположения синапсов также облегчает использование оптических инструментов (Fetcho и О'Мэлли, 1997; Fetcho и Higashijima, 2004). Мы добились очень хороших результатов при измерении эндо и экзоцитоза в живых рыб с помощью FM-красители и генетических показателей, таких как Synaptophluorin (Li и соавт., 2003). Кроме того, люминесцентные сопряженных токсины могут быть использованы для обозначения синаптические белки для работы с изображениями живой рыбы (Ibanez-Таллон и соавт., 2004). Учитывая простоту этого препарата имеет большие перспективы для будущего исследования.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pneumatic transducer tester	Fluke Biomedical	DPM1B
0.002 x 3 inch tungsten rod	A-M Systems	715000
Sylgard 184 Elastomer	Dow Corning		The thickness of application will affect the DIC optics