Экс естественных Расширение опухоли-реактивных Т-клеток посредством систем бриостатин 1/Ionomycin и общие гамма Сеть Цитокины Разработка

Резюме

Эффективный протокол для Исключая виво Расширение опухоли реактивных Т-клеток из опухоли дренаж лимфатических узлов или других вторичных лимфоидных тканей с опухолями хостов описано. Этот протокол расширяет выборочно опухолеспецифические Т-клеток для использования в приемных иммунотерапии рака молочной железы.

Аннотация

Как сообщалось, больных раком молочной железы у уже существующих иммунного ответа против ^1,2 опухолей. Однако такие иммунные реакции не обеспечивают полную защиту от развития или рецидива рака молочной железы. Чтобы преодолеть эту проблему путем увеличения частоты опухолевых-реактивных Т-клеток, усыновителей иммунотерапии был принят на работу. Различные протоколы были использованы для расширения опухолеспецифические Т-клеток. Эти протоколы, однако, ограничивается использование опухоли естественных бывший антигенов для активации антиген-специфических Т-клеток. Совсем недавно, общая гамма цепи цитокинов, таких как IL-2, ИЛ-7, Ил-15 и Ил-21 были использованы отдельно или в комбинации для повышения противоопухолевого иммунного ответа ^3. Тем не менее, не ясно, что формулировка будет работать лучше всего на расширение опухоли реактивных Т-клеток. Здесь мы приводим протокол для селективной активации и расширению опухоли реактивных Т-клеток от FVBN202 трансгенной мышиной модели HER-2/neu положительным раком молочной железы для использования в приемных Т-клеточной терапии рака молочной железы. Протокол включает в себя активацию Т-клеток с bryostatin-1/ionomycin (B / I) и ИЛ-2 при отсутствии опухолевых антигенов в течение 16 часов. B / I имитирует активации внутриклеточных сигналов, которые приводят к активации Т-клеток за счет увеличения протеинкиназы С активности и внутриклеточного кальция, соответственно, ^4. Этот протокол специально активирует опухоль-специфический Т-клеток, убивая не имеет значения Т-клеток. B / I активированных Т-клетки культивировали с IL-7 и ИЛ-15 в течение 24 часов, а затем импульсным ИЛ-2. После 24 часов, Т-клетки промывают, раскол, и культивируют с IL-7 + ИЛ-15 для 4 дополнительных дней. Опухоль-специфичность и противоопухолевой эффективности исключая виво расширил Т-клеток определяется.

протокол

1. Выделение лимфоцитов ⁵

1. Изолировать опухоли дренаж лимфатических узлов или селезенки с опухолями FVBN202 трансгенных мышей и подготовить суспензии отдельных клеток в ледяной RPMI1640 с добавлением 10% FBS. B / I активации в 50-мл полипропиленовые трубы конической результаты в большей выход Т-клеток по сравнению с полистиролом труб. Кетамин и Ксилазин вводят IP для анестезии. Шейки дислокации используется в качестве метода эвтаназии.
2. Культура клетки (10 ⁶ клеток / мл) в полной среде, содержащей 15% FBS с бриостатин-1 (5 нм) и иономицина (1 мкМ), а также 80 ед / мл ИЛ-2 (Peprotech) в течение 16 ч.
3. Вымойте клетки три раза теплой среде (37 ° С) и культуры на 10 ^{6 клеток} / мл в полной среде с IL-7 (10 нг / мл) и IL-15 (10 нг / мл) (Peprotech) в течение 24 ч .
4. Импульсный клетки с ИЛ-2 (40 ед / мл) в течение 24 ч.
5. Разделение клеток и культуру их с IL-7 и ИЛ-15 (10 нг / мл) в течение 4 дней. Изменение средних и разделить клетки при необходимости каждые 2 дня.

2. Определите Fold расширения Т-клеток путем клеток и проточной цитометрии Анализ ⁵

1. Клеток с помощью световой микроскопии
   1. Подготовка соответствующего разбавления ячейки (1:100) в трипанового синего и добавить несколько мкл на гемоцитометра
   2. Графа 9 квадратов и определить общего числа клеток путем деления клеток, чтобы количество камер умножается на коэффициент разбавления. Результаты поиска будут содержать числа х 10 ⁴ клеток / мл.
2. Определить долю CD8 + и CD4 + Т-клеток в клетки расширена с помощью проточной цитометрии
   1. Блок неспецифического связывания антител к Fc-рецепторов при культивировании клеток с anti-CD16/CD32 антител (Biolegend) в течение 20 мин на льду и затем промыть клетки в два раза с 2 мл ледяной PBS с добавлением 1% азида натрия .
   2. Пятно клетки при культивировании с FITC-CD4 и CD8 PE-антител в течение 20 мин на льду и затем промыть клетки в два раза с 2 мл ледяной PBS с добавлением 1% FBS и 0,1% азида натрия.
   3. Fix клеток с 1% параформальдегида и запускать образцы на Beckman Coulter FC 500 и анализ использования саммита версии 4.3 программного обеспечения.

3. Определите опухоли-специфичности бывших Расширенное Vivo Т-клетки

1. Культура исключая виво расширен лимфоцитов в полной среде в соотношении 10:1 с облученным нейтронов положительные опухолевые клетки MMC (15 000 рад) в течение 24 ч. ⁵
2. Урожай супернатанты и хранить при температуре -80 ° С до использования. ^5,6
3. Обнаружение IFN-γ использованием мыши ИФН-γ ИФА Set (BD Pharmingen) в соответствии с протоколом производителя. ^5,6

4. Определите Противоопухолевый Функция бывших Расширенное Vivo Т-клеток ^5,6

1. Инкубируйте Т-клеток с опухолевыми клетками в 10:01 эффекторных: целевые отношения в течение 48 часов в полной среде в 3 мл полной среды (RPMI-1640 дополнен 100U / мл пенициллина, 100μg / мл стрептомицина, 10% FBS, глютамина и β - меркаптоэтанол) и 20U / мл ИЛ-2 (Peprotech) в 6 также блюда культуры 37 ° C / 5% СО _2.
2. Выполните три цвета окраски антител для нейтронов (anti-c-Erb2/c-neu, клон-4, Calbiochem), затем РЕ-анти мышь IgG, Аннексин V-FITC и пропидия йодидом (PI) в соответствии с протоколом производителя (BD Pharmingen)
3. Ворота на нейтронов положительных клеток опухоли и анализа жизнеспособности (Аннексин V-/PI-) опухолевых клеток

5. Мышиной модели рака молочной железы

FVBN202 трансгенных самок мышей (Charles River Laboratories) может быть использован для источника опухоли реактивных Т-клеток. Эти мыши гиперэкспрессией неактивированных крысы нейтронов трансгенов под контролем промотора MMTV и в результате спонтанного развиваться рак молочной железы между 4-10 месяцев ^7. Эти мыши развиваться предраковые молочной гиперплазии похож на протоковой карциномы (DCIS) до развития спонтанных carcinoma8. Спонтанные опухоли мышей используются в качестве доноров Т-клеток.

6. Представитель Результаты:

Активация Т-клеток с B / I в течение 16 часов приводит к убийству наивных Т-клеток, которые не являются сенсибилизированные опухолей в естественных условиях. После B / I селективность опухоли реактивных Т-клеток, они расширяются до 2,8 раза в течение 6-дневной культуры с гамма цепи цитокинов (рис. 1). Оба CD8 + и CD4 + Т-клеток, в равной степени расширена гамма цепи цитокинов (рис. 2). Исключая виво расширенной Т-клетки проявляют высокую отзывчивость по отношению к опухоли, что донорские мышей, чувствительным к, как оценивается производство IFN-γ в присутствии нейтронов положительный рак молочной железы мыши (MMC), опухолевых клеток (рис. 3). Исключая виво расширил Т-клетки могут вызывать апоптоз в нейтроны положительный чел опухоли MMCLs, что жизнеспособность опухолевых клеток снижается с 92% до 61% в течение 48 часов (рис. 4).

Рисунок 1. Сложите расширение лимфоцитов в различные моменты времени следующие B / I активации (день 1) и экс расширения естественных условиях с цитокинами гамма цепи (дни 3, 5 и 7)

Рисунок 2. Всего процент CD4 + и CD8 + Т-клеток до и после 7-дневного расширения с цитокинами гамма цепи.

Рисунок 3. Опухоли-стимулированной IFN-γ производства Т-клеток, выделенных из опухолей мышей до и после 7-дневного расширения с цитокинами гамма цепи, с помощью IFN-γ ИФА

Рисунок 4. Цитотоксические функции исключая виво расширил Т-клеток с цитокинами гамма цепи против нейтронов положительный рак молочной железы мыши (MMC) опухолевых клеток

Обсуждение

Селективный расширение опухоли-реактивный Т-клеток с эффекторной противоопухолевой функция может быть достигнуто за счет предлагаемого протокола использованием B / I активации и экс расширения естественных условиях с гамма цепи цитокинов IL-2, ИЛ-7 и ИЛ-15. Хотя ИЛ-2 Т фактор рост...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bryostatin 1	Sigma-Aldrich	B7431-10ug
Ionomycin	Calbiochem	407950
Mouse IL-7	PeproTech Inc	217-17
Mouse IL-15	PeproTech Inc	210-15
Human IL-2	PeproTech Inc	200-02
RPMI1640	Invitrogen	11875
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
L- glutamine	Invitrogen	25030081
β- mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
anti-CD16/32 antibody	Biolegend	101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	556547
FITC-CD4	Biolegend	100406
PE-CD8	Biolegend	100708
anti-c-Erb2/c–Neu	Calbiochem	OP16
PE- anti mouse IgG	Biolegend	405307
formaldehyde	Polysciences, Inc.	04018
Hemocytometer	Hycor	87144
Light microscope	VWR international	V200073
Mouse IFN-γ ELISA set	BD Biosciences	555138
Cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175