Decellularization и Recellularization Целых Печень

Резюме

Перфузии decellularization это новый метод для получения целого леса печень, которая сохраняет внеклеточного матрикса органа состав и микроархитектуры. При этом, способ приготовления целого леса орган использованием decellularization перфузии и последующим репопуляции с гепатоцитов описывается. Функциональные и трансплантации печени трансплантаты могут быть получены с помощью этой техники.

Аннотация

Печень сложный орган, который требует постоянной перфузии для доставки питательных веществ и кислорода и удаления отходов, чтобы выжить ^1. Усилия, направленные на воссоздание или имитировать печени микроструктуры с основания до подхода с использованием тканевой инженерии и микротехнологий методы не увенчались успехом до сих пор из-за этой конструкции задача. Кроме того, синтетические биоматериалы для создания лесов для печени приложений тканевой инженерии были ограничены в индукции регенерации тканей и ремонт в значительной степени из-за отсутствия конкретной ячейке связывающие мотивы, которые будут обеспечивать надлежащее клеточных функций ^2. Decellularized родной ткани, такие сосуды ³ и кожи ^4, с другой стороны нашли много применений в тканевой инженерии, а также оказывали практическое решение некоторых проблем. Преимущество decellularized родной матрицы является то, что он сохраняет в определенной степени, оригинальные композиции и микроструктуры, следовательно, повышения вложений клеток и реорганизация ^5.

В этой работе мы описываем методы для выполнения перфузии-decellularization печени, такие, что интактной печени bioscaffold, который сохраняет структуру крупных кровеносных сосудов получается. Далее мы опишем методы recellularize этих bioscaffolds взрослых первичных гепатоцитах, создания трансплантата печени, что является функциональным в пробирке, и судно доступ к необходимым для трансплантации в естественных условиях.

протокол

1. Печень Decellularization

1. Урожай печени крыс с портальной вены с использованием катетеризации и 18 калибра катетер. Оставьте низшими и верхней полой вены открытым. Держите орган гидратированных в фосфатном буферном растворе (PBS) в 10-см чашке Петри.
2. Настройка перфузии система, состоящая из 8-литровый резервуар, перистальтического насоса и пузырь ловушку.
3. Заполните перфузии системы фосфатным буферным солевым раствором и сохранить это работает в течение 10 минут. Заполните PBS в 10-см чашку Петри и уменьшить расход фосфатным буферным солевым раствором до 1 мл / мин.
4. Тщательно передачи собранных печени фосфатным буферным солевым заполнены 10-см Петри.
5. Продолжайте перфузии PBS в течение ночи.
6. Начало перфузии с 0,01% (м / о) додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной воде в течение 5 минут.
7. Заливать с PBS в течение 1 часа.
8. Повторите шаги 1.6 и 1.7 еще три раза увеличивает время SDS перфузии до 10, 15 и 20 минут в каждый момент времени.
9. Продолжить перфузии с 0,01% (м / о) SDS в течение 24 часов.
10. Продолжить перфузии с 0,1% (м / о) SDS в течение 24 часов.
11. Заливать с 0,2% (м / о) SDS на 3 часа.
12. Заливать с 0,5% (м / о) SDS на 3 часа.
13. Заливать дистиллированной водой в течение 15 минут.
14. Заливать с 1% (м / о) Тритон Х-100 в дистиллированной воде в течение 30 минут, чтобы удалить какой-либо связаны нуклеиновых кислот.
15. Для мытья печени decellularized матрицы (DLM), заливать с PBS в течение 2 часов.
16. Дополнительно: резекцию всех долях, за исключением средней доле.
17. Магазин DLM в чистом и запечатаны чашку Петри пропитанные PBS при 4 ^° С до готовности для использования (рис. 1).
18. Для стерилизации DLM: 1) Флеш DLM стерильной PBS, содержащего 0,1% (об. / об) надуксусной кислоты и 4% (объем / объем) этилового спирта и выдержать в течение 3 часов при температуре 4 ^° С. 2) промыть стерильной PBS 2 раза. 3) Промыть стерильной PBS, содержащий 2% пенициллина стрептомицин, 10ug / мл гентамицина и 2,5 мкг / мл амфотерицина Б. Хранить decellularized печени в том же растворе при температуре 4 ^° С до готовности использовать для recellularization экспериментов.

2. Recellularization из Decellularized печени Матрица

1. Настройка перфузии система, которая состоит из перфузии камеры, перистальтического насоса и пузырь ловушку в стерильных условиях. Заполните перфузии система с 200 мл питательной среды, например, высокий уровень глюкозы в DMEM (Sigma), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone,), 100 U мл ^-1 пенициллина и 100 мкг мл ^-1 стрептомицин (Invitrogen).
2. Место decellularized матрицы печени в перфузионной камере и подключить к DLM перфузии системе через портал канюли вены, когда насос работает на 5 мл / мин, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
3. Разрешить перфузии среды, через DLM течение 30 минут.
4. Изоляция первичных гепатоцитах из взрослой крысы, по крайней мере 90% жизнеспособность.
5. Остановите поток в системе перфузии и медленно вводят 50 миллионов гепатоцитов (в 1-3 мл питательной среды) в системе перфузии через пузырь ловушку.
6. Начало течения при 10 мл / мин и рециркуляции среды в течение 10 минут.
7. Повторите шаги 2.5 и 2.6, пока в общей сложности 200 миллионов клеток вводятся в DLM (рис. 2) ^6.
8. После того как все клетки перфузии в DLM, собирать перфузат на четыре 50-мл центрифужные пробирки и центрифуги при 600 оборотов в минуту в течение 10 минут. Отменить супернатанты и собирать шариков в одну трубу. Определить количество клеток и жизнеспособность через трипанового синего исключения, чтобы определить эффективность посева.

3. In Vitro культуры трансплантата печени Recellularized

1. Настройка перфузии система, которая состоит из перфузии камеры, перистальтического насоса, оксигенатор и пузырь ловушку в стерильных условиях (рис. 3). Заполните перфузии система с 50 мл питательной среды, например, E Уильямса (Sigma), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone,), 0,5 U мл ^-1 инсулина (Eli Lilly), 20 нг мл ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 нг мл ^-1 глюкагона (Бедфорд Laboratories), 7,5 мкг мл ^-1 гидрокортизон (Pharmacia), 100 U мл ^-1 пенициллина и 100 мкг мл ^-1 стрептомицин (Invitrogen).
2. Место recellularized трансплантата печени у перфузии камеры и подключить к DLM перфузии системе через портал канюли вены, когда насос работает на 5 мл / мин, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
3. Асептических условиях близких перфузии камеры и плотно прилегают к исключить возможность утечки в культуре.
4. Передача перфузии системы инкубаторе, что составляет 37 ^° С и 10% CO ₂ и увеличение скорости перфузии потока до 15 мл / мин.
5. Подключение к оксигенатор 95% O ₂ и 5% CO ₂ баковых смесях газа и установить расход газа до 0,5 л / мин. Это должно достичь парциальное давление кислорода в приближенииtely 400 мм рт.
6. Культура может продолжаться до 10 дней с ежедневными изменениями культуральной среде. Культуральной среде может производиться отбор проб в день в течение контроль функции печени трансплантата, таких как альбумин, мочевина и общей секреции желчных кислот. В конце периода культуре, привитой recellularized печени может производиться отбор проб для молекулярной и гистологического анализа.

4. Представитель Результаты:

Полный decellularization из печени крыс занимает около 72 часов с использованием описанных протокола. Результирующая матрица сохраняет 100% коллаген фибриллярные, 50% гликозаминогликанов и только 5% ДНК родной печени (табл. 1) ^6. Сосудистые структуры матрицы сохраняется, о чем свидетельствует коррозии литья и сканирующей электронной микроскопии анализа (рис. 4) ^6. Наличие сосудистых микроархитектуры в DLM облегчает его заселение с клетками с КПД 96% и его последующее перфузии для культуры в пробирке. Трансплантата recellularized печени может быть культурным до 10 суток в пробирке и отображает собственные функции печени, что подтверждается с помощью альбумина, мочевины и общего секреции желчных кислот (рис. 5) ^6.

Рисунок 1. Decellularized печени матрицы в конце decellularization процесса. () Весь печени (б) средняя доля после резекции.

Рисунок 2. Схематическое изображение recellularization из DLM.

Рисунок 3. Перфузии настройки системы для экстракорпорального культура трансплантата печени recellularized.

Рисунок 4. Микрососудистых структура сохраняется в матрице печени decellularized. Коррозия изображения бросок) нормальной печени б) печень decellularized, портал (красный) и венозной (синий) сосудов. Сканирующей электронной микроскопии изображений DLM в) судно, г) раздел с участием желчных протоков, как мелких сосудов (стрелки), масштаб баров (а, б) 5 мм (в, г) 20 мкм.

Рисунок 5. Печень специфические функции recellularized трансплантата печени в течение в культуре перфузии пробирке. а) альбумин секреции (р = 0,5249), б) производство карбамида (р = 0,5271) и с) общего секреции желчных кислот (р = 0,0114). Статистический анализ различий между опытом и контролем было сделано за 10 период культуры г-испытатель Фридмана в = 0,01. Планки погрешностей представляют сем (п = 3).

	Свежий Ливера	Decellularized печени матрицы	р-значения	% Свежей печени
	п = 4	п = 8
Коллаген	0,07 ± 0,01	0,08 ± 0,03	0,56	114%
(Мг в печени г)
Гликозаминогликаны	73,1 ± 6,7	34,2 ± 2,9	0,004	47%
(Мг в печени г)
ДНК	14,9 ± 5,6	0,44 ± 0,08	3.3 10 -5	2,9%
(Мг в печени г)

Таблица 1. Биохимического состава матрицы печени decellularized по сравнению с родной печени.
Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка

Обсуждение

Метод перфузии decellularization описанные здесь производит целую печень эшафот с тем же валовой структуры и сосудистой микроархитектуры родной печени. Эшафот имеет внеклеточной матрицы составу похож на родной печени. Recellularization метода достигает репопуляции строительных лесов с клетками при ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149