Micropatterned Поверхности по изучению Гиалуроновая кислота Взаимодействие с раковыми клетками

Резюме

Новый подход, который позволяет с высокой разрешающей анализ взаимодействия раковых клеток с экзогенными гиалуроновой кислоты (ГК) описывается. Рисунком поверхности изготавливаются путем объединения карбодиимида химии и микроконтактной печати.

Аннотация

Вторжение рака и прогрессии предполагает подвижных фенотип клетки, которая находится под комплексное регулирование факторами роста / цитокинов и внеклеточного матрикса (ECM) компонентов внутри опухоли микроокружения. Гиалуроновая кислота (ГК) является одним из стромальных компонентов ECM, которые, как известно, способствовать прогрессии опухоли путем расширения вторжения, роста и ангиогенеза ^1. Взаимодействие HA с поверхности клетки рецептора CD44 вызывает сигнальных событий, которые способствуют рост опухолевых клеток, выживание, и миграция, тем самым увеличивая метастазирования ^2-3. ГК анионные, nonsulfated гликозаминогликана состоят из повторяющихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и DN-ацетилглюкозамина. Благодаря наличию карбоксильных и гидроксильных групп на повторяющиеся единицы дисахарид, родной HA в основном гидрофильные и поддается химической модификации, которые вводят сульфат группы для photoreative иммобилизации ^4-5. Предыдущие исследования с участием immobilizations ГК на поверхности используют bioresistant поведения ГК и ее производных сульфатированных для контроля клеточной адгезии на поверхности ^6-7. В этих исследованиях клеточной адгезии преимущественно происходит на не-HA регионах узорные.

Для анализа межклеточных взаимодействий с экзогенными HA, мы разработали узорной функциональными поверхностями, которые позволяют изучать и управляемых с высоким разрешением визуализации раковых клеток взаимодействия с ГК. Мы использовали микроконтактной печати (ОГП), чтобы определить дискретные узорной регионами ГК на стеклянных поверхностях. "Привязывать" подход, который применяется карбодиимида связи химии для иммобилизации HA было использовано ^8. Стекло поверхности были напечатаны с микроконтактной аминосиланом и реагирует с HA решения оптимизированы отношения EDC и NHS чтобы HA иммобилизации в узорной массивов. Включение карбодиимида химии с МКП включен иммобилизации HA в определенных регионах, создание поверхностей, пригодных для применения в пробирке. Оба толстой кишки раковые клетки и клетки рака молочной железы неявно взаимодействует с поверхностями HA micropatterned. Адгезии раковых клеток происходит в течение 24 часов с распространением на 48 часов. Использование HA micropatterned поверхностей, мы показали, что сцепление раковых клеток происходит через CD44 рецептором HA. Кроме того, HA узорной поверхности были совместимы с сканирующей электронной микроскопии (SEM) и позволил высоким разрешением рака выступы ячейки клея и распространения на модели HA анализировать подвижность раковых клеток от экзогенных HA.

протокол

1. Стандартный фотолитографии для изготовления Stamp Micropatterned

1. Промыть новых кремниевой пластины с этанолом и сухой с потоком воздуха. Используйте пинцет для обработки пластин и предотвращения дефектов поверхности в течение всего процесса.
2. Передача пластины вращаться нанесения покрытия и покрытия поверхности пластины с SU-2025 отрицательное фоторезиста. Обложка не менее 80% от пластин с фоторезистом. Спиновые пальто в течение 10 секунд на 600rpm, а затем 30 секунд при 3000 оборотов в минуту. Из-за фоточувствительность фоторезиста, выключите комнате свет с этой точки вперед.
3. Передача фоторезиста покрытые кремниевой пластины на плитке для «мягких-печь" при 95 ° С в течение 3 минут. Удалить из горячей плиты и позволяет 1 минуты, чтобы охладиться.
4. Место сборных маску с желаемым рисунком на верхней части фоторезиста покрытые кремниевой пластины и подвергать воздействию ультрафиолетового (УФ) излучения (350-450 нм) в течение 20 секунд.
5. Передача кремниевой пластины с горячей плитой для "жестких-печь" при 110 ° С в течение 6 минут.
6. Включите фары и удалить пластину из горячих пластины. Отдельные модели должны быть видны в этой точке.
7. Тщательно промойте кремниевой пластины с SU-8 фоторезиста разработчика. После 3 полоскания с разработчиком решение, промыть этанола. Если какой-либо белый осадок присутствует, повторите промыть фоторезиста решение разработчиков, или просто погрузиться в пластине разработчик решений в течение 2 минут и продолжить снова с этанолом полоскания. Промыть водой и просушите.
8. Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) решение эластомера и отвердителя в 10:01 весу. Центрифуга на 900rpm в течение 5 мин для удаления пузырьков воздуха.
9. Место узорной пластин в чашке Петри и залить PDMS на кремниевой пластине. Если Есть пузыри настоящее место в desicator и вакуумные на пару минут, пока пузырьки исчезают.
10. Cure ночь при комнатной температуре (RT) с образованием дополнительных штамп эластомерных. Если PDMS не полностью вылечены после 12 часов, поставить в духовку при температуре 60 ° С в течение 30 минут.
11. Осторожно снимите PDMS от пластины кремния. Используйте лезвию бритвы, чтобы сократить штампа нужного размера. Разрушать ультразвуком в этаноле в течение 15 минут. Вафли могут быть использованы несколько раз, чтобы создать новые марки эластомерных.

2. HA Micropatterning

1. Плазменные чистой стеклах в течение 5 минут. Поместите все слайды в камере и вакуум в течение 5 минут. Тогда позвольте низкий приток кислорода для входа камеры. Включите плазменный очиститель на 5 минут. Удалить из чистой плазмы и место в чашке Петри использованием щипцов.
2. Во время плазменной очистки, разрушать ультразвуком PDMS марки в этаноле в течение 15 минут.
3. Подготовка свежий 3% об. / раствор 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) в 95% об. / этанол в 15 мл центрифужную пробирку. Разрешить реагировать в течение 5 минут при комнатной температуре с образованием силанольных.
4. Место PDMS штамп шаблону на спину нанесения покрытий патрона и крышка узорчатой ​​поверхности раствором APTMS. Spincoat на 3500rpm в течение 30 секунд. Не прикасайтесь к поверхности штампа, только стороны штамп PDMS.
5. Передача APTMS решение плазмы очищается стеклянных поверхностей: установить марку вниз на одном конце узорные стороны и мягко скользят нажатием PDMS так что она полностью в контакте с поверхностью стекла в течение 1 минуты.
6. Удалить PDMS штамп мягко, и позволяют узорчатое стекло слайд для инкубации в РТ на 30 минут. Промыть узорной поверхности этанолом и высохнуть на воздухе. Разрушать ультразвуком PDMS штамп в течение 15 минут, чтобы удалить лишнюю APTMS.
7. Тепло поверхностей в духовке или на плитке в течение 1 часа при температуре 115 ° C. Полоскание с этанолом и сухим воздухом.
8. Подготовка свежих полиэтиленгликоля (PEG)-силана решение от 20% об. / 2 - [метокси (polyethyleneoxy) пропил] trimethoxysilane в толуоле. Это будет служить без клея область вокруг узоров.
9. Передача узорчатое стекло слайд в стеклянном блюде Петри и инкубировать в ПЭГ-силана решение в течение 45 минут при 75 ° С на горячей плите. Промыть толуол, вода и сухой воздух.
10. Стерилизовать в течение 1 часа с помощью УФ бактерицидные облучения в биологической кабинета безопасности. Действовать в кабинете биологической безопасности с этого момента для поддержания стерильности.
11. Подготовка водного стерильного раствора HA.
    10 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC)
    5 мм N-гидроксисукцинимида
    50 мкг / мл меченных флуоресцеином HA
12. Применить HA решение субстратов узорчатое стекло в стерильных условиях и в защищенном от света. Рисунком поверхности должны быть в покое на 16-24 часов.
13. Аспирируйте от HA решение, мыть с фосфатным буферным раствором (PBS), и покрывают поверхность с 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS в течение 1 часа. Поверхность готова к культуре клеток.

3. Культуре клеток на поверхности HA Micropatterned

1. Развернуть MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы и колоректального LS174T клетки карциномы, в соответствии с инструкциями производителя.
2. Семенной одного клеточные суспензии раковых клеток с плотностью от 0,4 до 1x10 ^{6 раковых клеток на 18,75 см 2 поверхности стекла и на HA иммобилизованных поверхностей. Инкубируйте в увлажненных инкубатор (37 ° С) в атмосфере поддерживается с 5% CO _2. Адгезия клеток должно произойти в течение 24 часов и может быть, наблюдаемые с помощью инвертированного микроскопа свет}
3. Поверхности клеточной культуры может поддерживаться до 5 дней в стандартных условиях инкубатора. Изменение средств массовой информации каждый день. Морфологии клеток и рост можно наблюдать с помощью инвертированного микроскопа свет. Дополнительная сотовой анализов могут быть применены для анализа ответов на поверхности HA.

4. Представитель Результаты:

Карбодиимида химии используется для ковалентно иммобилизовать га до APTMS слайды узорчатого стекла показана на рисунке 1А. EDC является нулевой длины сшивающего агента, который реагирует с ГК карбоксильных групп с образованием амин-реактивных промежуточных продуктов. Как это промежуточное подвержен гидролизу, NHS добавляется к увеличению карбодиимида эффективности реакции. Как HA решение взаимодействует с APTMS micropatterns, стабильной амидной связью между формами HA промежуточной и основной амин ATPMS. Примером поверхности HA узорной визуализированы использованием флуоресцентного микроскопа и интенсивности флуоресценции ImageJ анализ показал, узорные иммобилизации ГК показаны (рис. 1B-C).

HA micropatterned поверхности позволяют проводить изучение взаимодействия раковых клеток с expgenous HA. Оба MDA-MB-231 молочной железы человека и LS174t линий человека рака толстой кишки ячейки преимущественно придерживаются HA micropatterned регионов (рис. 2). Высокое разрешение изображения с помощью сканирующей электронной микроскопии может быть использована для анализа взаимодействия культивируемых клеток с ГК иммобилизованных поверхности (рис. 3).

Рисунок 1 HA micropatterned поверхностей () Схема описания развития ГК функциональные поверхности, (Б) изображение флуоресценции флуоресцеина (зеленый) меченных HA micropatterned поверхности. (C) 3D пикселей распределения карте с помощью программного обеспечения ImageJ демонстрируя дискретных моделей HA. Шкала бар = 100 мкм. Измененные с ⁹ с разрешения Elsevier.

Рисунок 2. Рака клеточной адгезии на поверхности HA micropatterned. Оба двоеточие () и грудь (В) рак преимущественно придерживался на HA патчи с 24 часов культуры. Измененные с ⁹ с разрешения Elsevier.

Рисунок 3. Раковых клеток взаимодействия с ГК. (А), сканирующей электронной микроскопии изображение рака толстой кишки клетки () культивировали на поверхности HA показано при малом увеличении (слева) и большом увеличении (справа; квадратов слева) и клеток рака молочной железы (B), культивируемые на поверхности HA показано на малом увеличении (слева) и большом увеличении (справа; квадратов слева).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод HA micropatterning представлены позволяет исследования клеточных взаимодействий с экзогенными HA. HA как известно, играет ключевую роль в прогрессии рака ^1, однако там были ограничены в исследованиях взаимодействия раковых клеток на двумерной поверхности HA узорные. Управляемыми исс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-2025 photoresist	MicroChem Corp.	Y111069
SU-8 developer	MicroChem Corp.	Y020100
Sylgard 184	Dow Corning
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)	Sigma-Aldrich	281778
2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7
1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	24500
Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA)	Sigma-Aldrich	F1177	Reconstitute with 10ml of DI water
MDA-MB-231 breast carcinoma cells	ATCC	HTB-26
LS174t colon carcinoma cells	ATCC	Cl-188