Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

Резюме

Определение механизмов, лежащих повреждение мышц имеет решающее значение. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Это позволяет анализировать морфологию мышц и локализация белка и других компонентов клетки мышц.

Аннотация

Молекулярная характеристика мышечной дистрофии и миопатии у людей выявил сложность заболевания мышц и генетический анализ мышечной спецификации, формирование и функции в модельных системах предоставил ценную информацию в мышечную физиологию. Таким образом, выявление и характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе повреждения мышц имеет решающее значение. Структура взрослых дрозофил мульти-волокна мышц напоминают позвоночных поперечно-полосатых мышц ¹ и генетических уступчивость дрозофилы сделала большой системы для анализа морфологии дистрофические мышц и охарактеризовать процессы, затрагивающие мышечной функции в процессе старения взрослых мух ^2. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Эти препараты позволяют ткани, которая будет окрашивали классических гистологических пятен и помечены с белком обнаружения красителей, и, в частности cryosections идеально подходят для иммуногистохимического выявления белка в интактных мышцах. Это позволяет для анализа структуры мышечной ткани, определение морфологических дефектов, и обнаружение экспрессии для мышечной / нейрон-специфических белков в мышцах дрозофилы взрослых. Эти методы также могут быть слегка модифицирован для секционирования других частей тела.

протокол

1. Подготовка

1. Недавно подготовить фиксатором Карнуа путем объединения абсолютного этанола, хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношении 6:03:01 соответственно. ³ Это, а также все решения для погружения воротники следует хранить в стеклянных банках окрашивания (см. раздел реагентов для рекомендации).
2. Подготовка алюминиевой фольги карманы правильный размер для воротников.
3. Подготовьте следующие решения в окрашивании банки: 2 х 40% этанол, 70% этанола, 2 х 100% этанол, метилбензоата (МБ), 50/50 об. / МБ и парафина, 2 х парафин. Место МБ и парафина контейнеров в термостат до 60-65 ° С.
4. Теплый парафин вылить в фольгу карманы до 60-65 ° С.

2. Крепление Летает в воротничков

1. Прикрепите воротник ⁴ под бинокулярным с помощью липкой ленты в вертикальном положении, где можно увидеть точки входа для летать.
2. Обезболить мухи использованием углекислого газа или с помощью гипотермии использованием ледяная глыба. Будьте осторожны, чтобы не заморозить мух.
3. Использование щипцов, подобрать индивидуальный мухи, захватывая их крыльев и поместить в воротник ориентированных правильно (головы и грудной клетки в верхней части лезвия и живота ниже лезвия). 10-20 мухи должны легко вписываться в воротник.

Примечание: Если вы анализируете несколько генотипов, не забудьте сделать сведению воротник номер и соответствующий генотип.

3. Парафин Разделы дрозофилы Thoraxes

1. Перемещение воротник к решению Карнуа и зафиксировать ткань при температуре 4 ° С в течение ночи.
2. После фиксации обезвоживают образца с помощью увеличения концентрации этанола. За 10 минут погрузиться воротник на 40% (2 раза), 70% и 100% (2 раза) этанола при комнатной температуре. Следующая воротник инкубировать в МБ и МБ + парафин решение (1:1) в течение 30 минут в каждой, а затем проникнуть воротник в две смены парафина в течение 60 минут каждый на 60-65 ° C. Быстро переместить воротник в фольгу карман и заполнить с топленым (60-65 ° С) парафин. Поместите его при комнатной температуре и позволяют парафином, чтобы стать жесткой (лучше всего оставить на ночь). Обратите внимание, что воротник можно поместить в карман в фольгу различной ориентации, в зависимости от ориентации разделы вам нужно (продольные или поперечные).
3. Берем сухой блоков парафина с воротниками из фольги и аккуратно отделить воротником из парафинового блока. С помощью острого лезвия или скальпеля аккуратно вырезать экстра-парафин со всего летать ткани.
4. Вырезать парафиновый блок с 7-10 мкм разделе шаги на вращение микротома и позволяют сократить ткани плавать квартиру в 37 ° С водяной бане. Место секционного ткани на полярных слайды и дать высохнуть в течение ночи. Эти слайды можно использовать для окрашивания hematoxyline и эозином (рис. 1А-D), толуидиновым синим, анилин синий или другой умирает для визуализации тканевых структур, а также для окрашивания антител (рис. 1E-E ``).

4. Cryosections дрозофилы Thoraxes

1. Как и парафиновых срезов, подготовке летит в ворота и моды кармана алюминиевую фольгу. Замораживания кулер будет, необходимых для подготовки образцов. Убедитесь, что кулер составляет около -60 ° C, используйте немного этанола и сухой лед, чтобы для достижения этой температуры. Час, прежде чем начать эксперимент положил бутылку крио-вложение среды (ткани-Tek октября соединения) вниз головой в 4 ° C холодильник, чтобы охладить его и свести к минимуму образование воздушных пузырьков.
2. Перемещение воротник с летит в фольге карман, который был предварительно охладить в течение нескольких минут внутри замерзания охладителя и быстро заполнять крио-вложение соединения. Пусть образец заморозить в течение 3-10 мин. Аккуратно развернуть формируется блок внутри кулера, мягко отдельный воротник из вложения блок и поместить его при температуре -20 ° С в течение не менее одного дня.
3. Вырезать замороженных мышц на крио-микротома от -15 до -18 ° C с раздела толщиной 10-15 мкм. Место на поляризованных слайдов и сохранить при температуре -20 ° С до готовности делать дальнейшую обработку. Мы предлагаем крепления ткани в 4%-ный раствор формальдегида PBS в течение 10 мин при комнатной температуре до антитела окрашивания.

5. Липиды обнаружения в мышцах дрозофилы

Липидные капли могут быть обнаружены с маслом красной O пятно на cryosections использованием протокола, принятого от Зибер и Thummel ^5.

1. После фиксации, мыть слайды с водой два раза в течение 5 мин, уравновешенную пропиленгликоля в течение 10 мин и инкубировать в течение 3 ч в масле красного пятна O при комнатной температуре. Затем промыть образцы 2 раза по 5 мин в пропиленгликоля и 30 мин в PBS. Горы в 30% глицерина.

6. Представитель Результаты:

Инжиррисунке 1. Парафиновыми-срезы
Hematoxyline и эозином окрашенных поперечных (АВ) и продольного (CD) разделы косвенные мышцы полета. А и С показывает нормальную структурированную мышц. Аномальные по размеру и морфологии мышц представлены на B и D соответственно (черные стрелки). Поперечный разрез окрашенных грудной клетки дрозофилы с анти-LAMC, ядерной маркер конверт и DAPI, ядерной пятна (EF). Увеличенное изображение нормального (красная стрелка) и ухудшилось (желтая стрелка), мышц (F). G представляет раздел дрозофилы кишечного тракта с окрашенных LAMC и DAPI.

Рисунок 2. Замороженные срезы
А. Поперечные закрепленные участки дрозофилы грудной клетки окрашиваются красным маслом O, этикетка липидные капли.
Б. Продольное замороженных срезах косвенных летательные мышцы окрашиваются анти-Dg, мышечные сарколеммой маркер и DAPI.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stainless steel collars	Home made		Specially constructed
Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Aluminum foil	Any Supplier
Blade or scalpel	Any Supplier
Wheaton macro staining jar	Wheaton	900200
Microtome	Carl Zeiss, Inc.		Model: Hyrax M25
Cryo-microtome	Leica Microsystems		Model CM3050S
60-65°C Incubator	Any Supplier		Large enough to hold at least 4 staining jars
Freezing cooler with metal block	Any Supplier		Store at -80°C
Super-frost slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	9161155
Cover slips	Any Supplier		Recommend 24 X 40 mm
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306	Analytical grade
Glacial acetic acid	Merck & Co., Inc.	100063	Analytical grade
Ethanol	Merck & Co., Inc.	100983	Analytical grade
Methylbenzoate	Sigma-Aldrich	M29908-500G	Analytical grade
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	76258	Paraffin
Tissue-Teck O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
16% formaldehyde, methanol free	Polysciences, Inc.	18814
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5150-1L