RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Резюме

РНК-интерференция была доказана очень эффективно анализировать функции генов в Drosophila Трахеи развития. Подробное протокол, используемый Цзян лаборатории, чтобы придать дсРНК в летают эмбрионов нокдауна экспрессии генов иллюстрируется. Эта технология обладает потенциалом для скрининга генов, необходимых для развития тканей и органов в Drosophila.

Аннотация

Генетический скрининг является одним из самых мощных методов, доступных для получения взглянуть на сложный биологический процесс, ^1. За эти годы много улучшений и инструментов для генетических манипуляций стали доступны у дрозофилы ^2. Вскоре после первоначального открытия Фри и Мелло ^{3 видно,} что двухцепочечной РНК могут быть использованы для нокдаун активности отдельных генов в Caenorhabditis Элеганс, РНК-интерференция (RNAi) было показано, что обеспечивает мощный обратный генетический подход к анализу функций генов в развитии дрозофилы орган ^{4, 5.}

Многие органы, в том числе легких, почек, печени, сосудистой системы, состоят из трубчатых разветвленных сетей, транспорта жизненно важные жидкости или газы, ^{6, 7.} Анализ дрозофилы трахеи образование обеспечивает отличную модель системы для изучения морфогенеза других трубчатых органов ^8. Беркли дрозофилы генома проекта выявил сотни генов, которые выражаются в трахеи системы. Для изучения молекулярных и клеточных механизмов трубки образования, задача состоит в том, чтобы понять роль этих генов в развитии трахеи. Здесь мы описали подробный метод дсРНК инъекции в эмбрион дрозофилы нокдаун отдельных экспрессии генов. Мы успешно сбил эндогенных dysfusion (дисфункции) экспрессии генов с помощью инъекции дсРНК. Дисфункции является bHLH-PAS белка выражается в клетках трахеи синтеза, а это необходимо для трахеи филиала слияние ^{9, 10.} дисфункции RNAi полностью устранить дисфункции выражение и в результате трахеи дефект синтеза. Этот сравнительно простой метод обеспечивает инструментом для выявления генов requried для tissure и развития органов у дрозофилы.

протокол

1. Эмбрион коллекции

1. Настройка клетки при 25 ° С с использованием 2-4 дневных ш ¹¹¹⁸ пластин сок flies.Grape меняются каждый час в течение суток для синхронизации сбора яиц в течение 1-2 дней до сбора
2. Сбор эмбрионов в 1 час при 25 ° С
3. Отрежьте прямоугольный кусок виноградного сока агар, вырезать слегка в середине с лезвием, оставьте строку в агар
4. Используйте металлический зонд для передачи эмбрионов из виноградного сока пластины Вашей части виноградного сока агар, выстроить их в прямой линии с длинной оси эмбриона на 45 градусов к линии в середине агара. Получите прямой около 50 эмбрионов. Убедитесь, что все эмбрионы указывают в одном направлении, с задним концом направлен от линии.
5. Отрежьте прямоугольный кусок двойной ленты палки, и поместить его в 18x18mm скольжения покрытия.
6. Возьмите эмбрионов с двойной ленты палки на покровное стекло
7. Место покровным стеклом, чтобы стекло, сухие эмбриона в воздухе около 10 мин.
8. Обложка эмбриона с тонким слоем масла Хладон 700, сейчас он готов для инъекции.

2. Тяговая иглы

Сделать микроинъекции иглы, потянув стеклянные капилляры. Мы используем иглы съемник от Всемирного точный инструмент (модель ПУЛ-1). Иглы спецификации съемник программы являются: тепло: 1, задержка 4.

3. Заполнение иглы

Вернуться нагрузки иглы использованием Eppendorf p20 пипетки оснащены Эппендорф советы Microloader, как правило, нагрузка 1.5-2 мкл дсРНК

4. Перерыв иглы

1. Перед тем как игла, место покровное на слайде.
2. Подготовка слайдов с каплей масла в середине слайда
3. Включите Picospritzer III picopump для регулировки давления воздуха
4. Перерыв заполнен иглу к краю покровным стеклом, создавая острие.
5. Когда кончик сломан, шаг на педали из Picospritzer III picopump, некоторые дсРНК будет вытекать из иглы.
6. Выньте слайд с покровным.
7. Введите иглу под жировая капля в середине слайд подготовлена ​​раньше.
8. Отрегулируйте настройку Picospritzer III picopump, чтобы получить 100-200pl дсРНК когда вы выходите на педали. дсРНК можно рассматривать как небольшой капли.

5. Инъекция

1. Принесите иглы к задней части первого эмбриона бластодерма в ту же фокальной плоскости и ввести эмбрион от центра около 30-50% длины яйца.
2. После того как вы шаг на педали из Picospritzer III picopump, небольшое количество дсРНК будет выглядеть как маленькая точка в месте инъекции.

6. Фенотипический анализ

1. После инъекции место вставляются покрыты влажной камере (пластиковые чашки Петри) при 18 ° С до эмбрионы развиваются до желаемого зачаточном состоянии.
2. Используйте зонд, чтобы удалить из эмбрионов двусторонний скотч и подтолкнуть их к краю крышки скольжения.
   Вымойте эмбрионов за пределы слайда в коллекции флакон с нейлоновая сетка на дне использованием гептан, промыть 3 раза PBT.
   Dechorionate эмбрионов в 50% отбеливателя в течение 5 минут, и промыть 3 раза PBT.
   Трансфер эмбрионов из коллекции флакон на кусок нейлоновой сетки, а затем падение нейлоновая сетка в фиксирующий раствор (5 мл гептана, 4,5 мл PBS, 0,5 мл 37% формальдегида), чтобы освободить эмбрионов. Fix эмбрионов в фиксирующий раствор в течение 30 минут.
   Devitellinize эмбрионов с метанолом, трансфер эмбрионов трубки Эппендорф, и immunostain эмбрионов с использованием стандартных протоколов.
3. Эмбрионы могут также разработать соответствующие личиночной стадии.
4. Подготовка слайдов с каплей масла хладон 700 в середине
5. Передача один личинок на слайд, положить покровное стекло на верхнем
6. Соблюдайте личинки при ярком поле микроскопа.

7. Представитель Результаты:

Примером дсРНК сбить dysfusion (дисфункции) генов в эмбрион Drosophlia показан на Рис1. GFP-дсРНК вводят эмбрионы отрицательного контроля. Дисфункции является транскрипцией bHLH PAS фактор выражается в клетках трахеи синтеза. GFP-дсРНК вводят эмбрионы демонстрируют нормальное трахеи синтеза, а DYS белок присутствует в области термоядерного синтеза клетками (рис. 1А). С другой стороны, дисфункции дсРНК вводят эмбрионы не удалось показать филиала синтеза, а DYS белки нет в слиянии клетки (рис. 1В). Когда дсРНК вводят эмбрионы развиваются до личиночной стадии, дисфункции дсРНК вводят личинок показали удалось филиала синтеза (Fig.1D) по сравнению с GFP-дсРНК вводят отрицательного контроля (рис. 1в). Эти результаты показали, эффективное сбить эндогенной экспрессии генов дисфункции по дсРНК инъекции в эмбрионы дрозофилы

Рисунок 1. Удаление дисфункции функции дисфункции RNAi показывает, трахеи слияние гвидеоэффекты. Бластодерма эмбрионов (W ¹¹¹⁸⁾ вводили либо GFP-дсРНК (отрицательный контроль) или дисфункцией дсРНК и анализировали на трахеи дефектов. () Этап 16 эмбрион вводят GFP-дсРНК и окрашивали α-DYS и МАБ 2A12, что пятна трахеи просвет. Заметно показан боковой ствол, который расплавился. Стрелки указывают на боковой ствол DYS-положительных клеток синтеза. (В) Этап 16 эмбриона вводят дисфункции дсРНК и окрашивали α-DYS и МАБ 2A12. Эмбрионов показало отсутствие бокового ствола слияния (звездочка означает нормальное расположение бокового ствола синтеза в контрольных эмбрионов). Нет DYS-положительных клеток наблюдалось, что свидетельствует о дисфункции РНК по сути упразднил DYS белка. (От С до D) второго возраста личинки либо с GFP-дсРНК или дисфункции дсРНК были рассмотрены светлого поля микроскопию для трахеи дефектов. (C) Сайты плавления обозначены звездочкой в ​​GFP-дсРНК вводят контроль личинок. (D) бокового ствола не удалось соединить в дис-РНК вводили личинки, (*) указывает нормальное расположение боковых слияние ствола.

Обсуждение

Метод дсРНК инъекции присутствует здесь дает очень чувствительный и быстрый анализ функций генов дрозофилы трахеи развития. Этот метод потенциально может быть применена для анализа функции гена и для других тканей и органов развитии.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III picopump	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Micro-pipettes	Fisher Scientific	21170M
Microloaders	Eppendorf	930001007