Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Резюме

В этом протоколе мы представляем метод измерения Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных.

Аннотация

Продолжительность жизни является биологический процесс регулируется несколькими генетическими путями. Одна из стратегий для исследования биологии старения является изучение животных, которые укрывают мутации в компонентах возрастных нормативных путей. Если эти мутации возмущать зависимости от возраста-регуляторные пути и, следовательно, изменить продолжительность жизни всего организма, они обеспечивают важные механистического понимания ^1-3.

Еще одна стратегия для расследования регулирование продолжительности жизни заключается в использовании небольших молекул, отвечающих за нарушение возрастных нормативных путей. На сегодняшний день, число молекул, как известно, увеличить продолжительность жизни в различных модельных организмов и используются в качестве инструмента для изучения биологии старения ^4-16. Число молекул, установленные на данный момент мало по сравнению с генетическим "набор инструментов", которая доступна для изучения биологии старения.

Caenorhabditis Элеганс является одним из основных моделей, используемых для изучения старения из-за своей отличной генетикой и короткой продолжительности жизни на три недели. Совсем недавно C.elegans стала модель организма для фенотипа основан экраны наркотиков ^5,7,16-20 из-за ее небольшого размера и ее способности расти в микротитровальных пластин.

Здесь мы представляем анализ для измерения C.elegans продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных. Анализ был разработан и успешно используется для выявления крупных библиотек для молекул, которые простираются C.elegans жизни ^7. Надежность анализа была оценена в несколько тестов: во-первых, путем измерения продолжительности жизни диких животных, типа, выращенных при различных температурах, во-вторых, путем измерения продолжительности жизни мутантов с измененными продолжительность жизни, в-третьих, путем измерения изменений в продолжительности жизни в ответ на различные концентрации из антидепрессант Mirtazepine. Mirtazepine Ранее было показано, чтобы увеличить продолжительность жизни в C.elegans ^7. Результаты этих тестов показывают, что анализ может повторить предыдущие результаты других анализов и носит количественный характер. Микротитровальных формат также делает этот анализ продолжительности жизни совместима с автоматизированными системами обработки жидких и позволяет интегрировать в автоматизированные платформы.

протокол

Обзор: протокол разделен на четыре части. Часть 1 описывает, как готовить питание бактерий. Часть 2 описывает, как подготовить червь культуры. Часть 3 описывает, как оценка продолжительности жизни. Часть 4 показывает некоторые репрезентативные результаты, и часть 5 описывает, как подготовить необходимые решения. Продолжительность жизни эксперименты занять несколько недель. Для каждого шага протокола неделю, день и время дня включен, чтобы облегчить планирование. Стадии L4 (день 0) используется как точка отсчета для всего протокола.

1. Подготовка кормления бактерии

В этом разделе описывается подготовка питание бактерий. Конкретные Е. палочки штамма использоваться для подачи C.elegans называется OP50. До этого протокола, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение червь культуры с другими бактериями, OP50 штамм был достигнут Карбенициллин / Ампициллин устойчивы ^21. Подготовка OP50 четыре-пять дней вперед. Все материалы, контактирующие с OP50 должны быть стерильными.

День -7: четверг (неделя 1): привить 5 мл туберкулеза, содержащий 100 мкг / мл ампициллина и 0,1 мкг / мл Амфотерицин с одним OP50 колонии и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° С в бактериальных шейкер.

День -6: пятница (неделя 1).

Утро 8:30. Прививать рано, чтобы обеспечить достаточное время для культуры для достижения насыщения

1. Развести ночь культуре OP50 1:2000 в 300 мл ТБ, содержащей 50 мкг / мл ампициллина. Инкубируют культуры в бактериальных шейкере в течение 8-12 часов при 37 ° C до насыщения. Не позволяйте культуры расти более чем на 14 часов.
2. Передача OP50 в стерильную, предварительно взвешенный центрифугирования пробирку. Гранул OP50 центрифугированием в течение 10 мин при 3500 оборотов в минуту (2200 мкг) в столешницу центрифуги.
3. Удалите супернатант и вновь приостановить OP50 гранул в стерильной воде и повторно гранул с помощью центрифугирования. Повторите это мыть два раза.
4. После второго мытья, тщательно удалить всю оставшуюся воду. Вода не должна оставаться в трубке. Взвесьте центрифугирования пробирку гранул и вычесть вес пустой трубки центрифугирования, чтобы определить вес гранул.
5. Тщательно повторно приостанавливать пеллет в S-полной до концентрации 100 мг / мл. Нет скопления должны быть оставлены.
6. Концентрации 100 мг / мл OP50 должна соответствовать 2 x10 ¹⁰ бактерий / мл. Использование фото-спектрометр для определения количества бактерий на мл, если отношения между оптической плотности и количества бактерий на мл известно. Если необходимо, отрегулируйте концентрацию OP50 решение кормления до 2 x10 ¹⁰ бактерий / мл.
7. Магазин OP50solution при 4 ° С, пока не будет использован для червя культуры.

2. Подготовка Синхронные культуры Worm

В этом разделе описывается подготовка червь культуры. Ее цель заключается в создании возрастных синхронных населения червей. Все материалы, контактирующие с C.elegans после отбеливания лечение в шаге 5, должны быть стерильными. Плиты хранятся при температуре 20 ° С, если не указано иное.

День -6: пятница (неделя 1), 4:00 вечера: Трансфер животных свежие пластины

1. Возьмите 5-10 дневных пластины NGM, на котором большинство населения червя состоит из голода личинки L1.
2. Стерилизовать металлическим шпателем, ненадолго нагревании над горелкой Бунзена. Пусть это круто. Использование охлажденного лопаточку, чтобы вырезать куски из агар пластины, содержащей голодали червей. Передача некоторых из этих кусков на 10 см свежего NGM пластины с присадками OP50. Инкубировать в течение ок. 65 часов при 20 ° С, пока большинство населения червя состоит из беременных взрослых. Время, которое требуется от голода животные L1 вырасти в беременных взрослые могут варьироваться в зависимости от штамма к штамму.

День -3: понедельник (неделя 2) 10:00: создание синхронного населения

3. Сбор червей от 10 см пластины, вымойте их от пластины с 5-10 мл стерильной воды. Передача червь / водного раствора в 15 мл коническую трубку.
4. Вымойте червей путем центрифугирования 2 мин в настольной центрифуге при 1200 оборотов в минуту (280 мкг). Удалите супернатант и добавить 10 мл воды. Повторить.
5. Удалить супернатант и добавьте 5 мл свежеприготовленного отбеливателя / NaOH раствор (2,5 мл отбеливателя, 1 мл 10N NaOH, 6,5 мл H ₂ O). Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, пока черви взломать. Убедитесь, что вихрь аккуратно каждую минуту. Осуществляют контроль за ходом реакции при вскрытии микроскопом.
6. Как только все взрослые растворится, добавить 5 мл M9 буфер для нейтрализации реакции.
7. Мойте яйца в три раза по 10 мл буфера M9 центрифугированием 2 мин при 2500 оборотов в минуту (1100 мкг).
8. Мойте яйца один раз с 10 мл S-полной центрифугированием 2 мин при 2500 оборотов в минуту (1100 мкг).
9. Удалить супернатант, добавить 10 мл S-полной и передачи решения свежие 50 мл коническую трубку. Добавить 30 мл S-полной, чтобы окончательный объем 40 мл. Осторожно встряхните трубки на ночь при комнатной температуре на nutator или аналогичного устройства.

День -2: вторник (неделя 2), 12:00: семенной животных в пластинах

10. Под рассекает сферу, проверьте, червей вылупились в ночное время. Определить концентрацию червей в S-полное решение путем подсчета количества червей в 10 мкл капли использованием рассекает области. Граф не менее 10 капель для каждого образца.
11. Повторное приостановить червей в концентрации 80-100 черви / мл в S-полной. Добавить Карбенициллин (акций 100 мг / мл) до конечной концентрации 50 мкг / мл и амфотерицин В (акций 250 мкг / мл) до конечной концентрации 0,1 мкг / мл. Встряска на nutator. Если подготовке большего количества червей, используйте 600 мл колбу с nunclon крышку фильтра.
12. В 2:30 вечера добавить OP50 подготовлены в Части 1 до конечной концентрации 6 мг / мл (= 1,2 x10 ⁹ бактерий / мл). Вернуться OP50 до 4 ° C.
13. Передача 120 мкл worm/OP50 раствора в каждую лунку 96-луночного планшета. Использование 96-луночных с прозрачным дном. Удостоверьтесь, чтобы держать червей в виде суспензии в то время как пипетки.
14. Печать пластины с использованием ленты герметик, чтобы избежать загрязнения и испарения. Встряхните пластину на планшет шейкере в течение 2 мин и инкубировать в течение 2 дней при 20 ° С, пока животные достигают L4 стадии.

День 0: четверг (неделя 2) до полудня: стерилизовать животных, добавив Fluorodeoxyuridine (ФУДР)

15. Для стерилизации животных добавить 30 мкл 0,6 мМ ФУДР маточного раствора в каждую лунку. Этот шаг дает конечный объем в каждую лунку по 150 мкл и снижает конечную концентрацию OP50 от 6 мг / мл до 5 мг / мл (1х10 ⁹ бактерий / мл). Печать пластины с помощью липкой ленты герметики и встряхните его в течение 2-3 мин на планшет шейкер. Если OP50 был добавлен в 2:30 в день -2, важно, чтобы ФУДР добавляется до полудня. Вернуться пластин 20 ° C инкубатор

1 день: пятница (неделя 2): Добавить препаратов для культуры

16. К 9:00 утра большая часть животных должна быть беременной и содержат несколько яиц каждый. Добавить препаратов, действие которых на продолжительность жизни должна быть испытана на нужной концентрации. Если растворения препаратов в ДМСО конечных концентраций ДМСО не должна превышать 0,6%, как ДМСО концентрациях выше 0,6% сократить C.elegans продолжительность жизни. После добавления наркотиков, печать пластин с лентой герметик и встряхните его в течение 2-3 мин на планшет шейкер. Вернуться пластин 20 ° C инкубатор
17. Добавление препаратов иногда могут убить несколько животных на пластину, особенно при использовании растворителей, кроме воды. Используйте инвертированный микроскоп для проверки мертвых животных. Вообще, не должно быть менее 10 мертвых животных в 96 ячейках. Вернуться пластин 20 ° C инкубатора.

4 день: понедельник (3 недели): Изменение герметики

18. Чтобы разрешить свежего кислорода, чтобы войти в культуру удалить герметик, подождите 1 минуту и ​​запечатайте пластины. Встряхните пластины в течение 2-3 минут на планшет шейкер. Повторить один раз в неделю.

День 5: Вторник (неделя 3): Добавить новый OP50 предотвращения голода

19. Добавьте 5 мкл 100 мг / мл OP50 решение, которое было подготовлено в части 1 для каждой из 96 лунок, чтобы предотвратить голод.

3. Подсчет очков в жизни.

Этот раздел описывает, как выживание синхронизированы червь населения Часть 2 контролируется, пока животные погибли. Чтобы наблюдать за животными в 96-луночных, используйте инвертированный микроскоп с 2x или 2.5x цели. Запись данных выживания три раза в неделю, по понедельникам, средам и пятницам. Использование движения для определения животных живыми или мертвыми. Сильный свет, особенно синий свет, индуцирует животных двигаться. Не удаляйте мертвых животных из теста. Иногда животные, которые не двигались и были полны решимости мертвым в предыдущем подсчет может двигаться в дальнейшем.

1. В день 0 в начале эксперимента подсчет общего количества червей в каждую лунку. Цензор скважин, которые содержат более 18 животных из анализа, как животные в этих скважин не хватит OP50 и покажет последствия диетических ограничений.
2. Для того, чтобы увеличить вероятность, что животные двигаются встряхнуть 96 ячейках на планшет шейкере в течение 2 мин. перед подсчетом.
3. В каждом подсчете сессии, дата регистрации и количество животных, которыхдвижутся как живые животные. Движение в жидкости гораздо легче, чем на твердой среде и может быть вызвано сильным огни. Использование большем увеличении может помочь обнаружить очень тонкие движения, как у кончика глотки. Такие тонкие движения зачастую являются единственным движение наблюдается у очень старых животных.
4. Вернуться пластин 20 ° C инкубатор
5. Повторите шаги 2-4, каждые два-три дня, пока все животные погибли.

4. Представитель результаты.

Этот раздел показывает пример того, как вести учет данных продолжительность жизни, порожденная этим анализа и некоторых репрезентативных результатов.

Рисунок 1А показывает пример того, как для записи данных во время жизни этого анализа. Листа Excel используется для отслеживания выживания населения в каждую лунку. Для каждого хорошо это координата в пластину, процедить, наркотиков, концентрация наркотиков и общее количество животных в живых в день 0 (X0) записывается в начале эксперимента. Дата записи, а также количество живых и мертвых животных три раза в неделю для того, чтобы следить за выживание различных групп населения в каждую лунку. Для графа результаты, вычислить долю животных живыми для каждого дня и график ее как функцию времени в днях. P-значения должны быть вычислены с использованием статистических пакетов, таких как STATA или аналогичного программного обеспечения.

Средний срок службы C.elegans зависит от температуры. На рисунке 1б показывает, что зависит от температуры изменения в жизни точно воспроизведены микротитровальных основан срок службы анализа ^22. Кроме того, анализ планшет воспроизводит изменения в продолжительности жизни от мутантов, как сообщается, продолжительность жизни, которые отличаются от дикого типа N2 животных ^{23-24 25} (рис. 1в).

Анализ также может быть использован, чтобы сделать больше количественных утверждений. В среднем продолжительность жизни Fig1D строится в зависимости от концентрации Mirtazepine ^7. Каждая точка данных представляет собой среднюю продолжительность жизни 7-12 населения, каждый живет в другом хорошо. Хотя количество животных на лунку является относительно низким (5-15 особей) обеспеченных также изменения относительно невелика, как видно из погрешности.

Рисунок 1. Планшет основан срок службы анализа точно воспроизводит изменения в продолжительности жизни в литературе.
() Пример данных, собранных в таблицы Excel. Во время каждой сессии подсчета дату, координаты хорошо, и количество живых и мертвых животных был записан. В начале эксперимента, общее количество животных в каждой лунке было определено. (В) кривая выживания дикого типа (N2) животных, выращенных при 20 ° C до 25 ° C. (C) Кривые выживаемости штаммов проведение мутаций, влияющих на продолжительность жизни. Все четыре штамма были проанализированы параллельно при 20 ° C. (D) Доза кривую реакции Mirtazepine подопытных животных N2. Средняя продолжительность жизни на графике как функция Mirtazepine концентрации. Ошибка полоски показывают SEM из 8 скважин в состоянии.

5. Материалов.

M9 буфер, 1000 мл

• 6 г Na ₂ HPO ₄
• 3 г KH ₂ PO ₄
• 5 г NaCl
• 0,25 г MgSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• Добавить деионизированной водой до 1000 мл
• Автоклав

Potassiumphosphate буфера рН 6,0, 1000 мл

• 136 г KH ₂ PO ₄
• Добавить деионизированной водой до 900 мл
• Отрегулируйте рН до 6,0 с 5М KOH
• Добавить деионизированной водой до 1000 мл
• Автоклав

Трассировка металла решения

• 1,86 г Na ₂ EDTA
• 0,69 г FeSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• 0,20 г MnCl ₂ ∙ 4H ₂ O
• 0,29 г ZnSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• 0,016 г CuSO ₄
• 1000 мл деионизированной воды
• Автоклавы и хранить в темноте.

S-базальной среды, 1000 мл

• 5,9 г NaCl
• 50 мл 1М фосфата калия, рН 6,0
• 1000 мл деионизированной воды
• Автоклав
• Пусть решение остыть, а затем добавить 1 мл 5 мг / мл холестерина (растворенный в Et-OH).

Калий 1M цитрат, 1000 мл

• 268,8 г цитрата трикалия
• 26,3 лимонной кислоты моногидрат
• Добавить 900 мл деионизированной воды
• Отрегулируйте рН до 6,0 с 5М KOH
• Добавить деионизированной водой до 1000 мл
• Автоклав

S-полной среде, 1000 мл

• 977 мл S-базальных
• 10 мл 1М рН цитрат калия 6 (стерильные)
• 10 мл следов металлов решения (стерильные)
• 3 мл 1М CaCl ₂ (стерильный)
• 3 мл 1М MgSO ₄ (стерильные)

NGM агар

• 3,0 г NaCl
• 2,5 г пептон(Из казеина, поджелудочной дайджест)
• 17g Агар
• Добавить деионизированной водой до 975 мл и мешалки
• Автоклав
• После автоклавирования остыть до 55 ° С и добавить следующие компоненты:
  • 0,5 мл 1М CaCl ₂ (стерильный)
  • 1 мл 5 мг / мл холестерина в этаноле
  • 1 мл 1 М MgSO ₄ (стерильные)
  • 25 мл Potassiumphosphate буфере, рН 6,0 (стерильные)

ТБ, 1000 мл

• 12г Бакто триптон
• 24 г Дрожжевой экстракт
• 4 мл глицерина
• Добавить 900 мл деионизированной воды
• Автоклав
• После автоклавирования остыть до 55 ° С и добавить следующие компоненты:
  • добавить 100 мл 0.17M KH ₂ PO ₄ / 0.72MK ₂ HPO ₄

0,6 мм Fluorodeoxyuridine (ФУДР, сигма кошка # F0503), 1000 мл

• 100 мг ФУДР
• Растворить в 670 мл стерильного S-полной, составляют 10 мл и 45 мл порциями.
• Хранить при -20 ° C.

100 мг / мл Карбенициллин, 10 мл

• 1 г Карбенициллин
• 10 мл стерильной деионизированной воды
• Стерильный фильтрат и аликвоту
• Хранить при -20 ° C.
• Использование при конечной концентрации 50 мкг / мл

250ug / мл амфотерицина, 4 мл

• Амфотерицин В 1 мг
• 4 мл Et-OH
• Хранить при температуре от -20 ° C
• Использование в конечной концентрации 0,1 мкг / мл

Обсуждение

Протокол представлен позволяет измерять C.elegans продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных. Как показано в разделе репрезентативные результаты он надежно повторяет предыдущие выводы и предоставляет количественную информацию. С помощью этого анализа мы успешно экранированный более 89000 молекул для их влияние на C.elegans продолжительность жизни.

В целях наркотиков скрининга, измерения продолжительности жизни в 96 формате планшет имеет ряд преимуществ перед классическим твердым анализа СМИ. Это снижает трудоемкость подготовки СМИ, сумма инкубации пространстве, и количество препарата требуется. 96-луночного формата и микроскопии установки позволяют автоматизацию всего тест для высокой пропускной показы.

В ходе разработки анализа нескольких значений для каждой переменной и их комбинации были проверены на их воздействие на C.elegans продолжительность жизни. Эти тесты включали различные OP50 концентрации от 3 до 10 мг / мл (3, 4, 6, 8, 10 мг / мл), разное количество червей на лунку от 7 до 45 (7, 10, 15, 22, 45 черви / лунку), разные объемы культуры от 40 до 150 мкл на лунку (40, 60, 80, 100, 120, 150 мкл), а также изменения в буфере состава. Если кормить Карбенициллин устойчивые OP50, ни Карбенициллин ни Амфотерицин в концентрациях указанных оказались влияют C.elegans продолжительность жизни. Непрерывная осторожном встряхивании пластин, как это часто рекомендуется в C.elegans жидкой культуры, была найдена необязательной для небольших объемов, используемых в этом анализе. Нежный встряхивая, однако, требуется, если микротитровальных пластин с большим скважин, которые будут использоваться. Значений, указанных в данном протоколе, были тщательно отобраны на основе статистического сравнения различных условий испытания.

Наиболее удивительная особенность этого анализа, вероятно, тот факт, что C.elegans может храниться в 96-луночных, которые запечатаны с лентой. Бок-о-бок сравнения не выявили никакой разницы в продолжительности жизни животных культивировали в распечатал плит, в виде пластин запечатанный пластиковый герметик, или в виде пластин запечатанный герметиков, которые позволяют воздухообмена. Во всех трех условий, животные развивались очень однородно из L1 для беременных взрослых в течение 65 часов и показали очень сопоставимы продолжительности жизни. Животные выросли параллельно на NGM разработали несколько быстрее, но эта разница не зависела от наличия или отсутствия герметика.

Представлен протокол основан на живых бактерий, но могут быть адаптированы для мертвых бактерий. Однако, в жидком анализа одного выжить бактерии могут быстро размножаться и повторного заполнения культуры. В наших руках, единственный надежный способ уничтожения бактерий при условии, что они могут быть использованы для жидких культура является длительной обработки бактерий с гамма-облучения.

Один важный момент необходимо учитывать при планировании эксперимента продолжительность жизни мощность обнаружения. В зависимости от размера эффекта, действие препарата заинтересованности должны быть испытаны в нескольких скважинах. В обычном анализе 4 наркотиков обращению и 4 контроль скважин, что соответствует примерно до 40-50 животных в каждой, должно хватить для обнаружения 30%-ное увеличение продолжительности жизни в более чем 95% от экспериментов. Увеличивает на 14% обнаруживаются только в 60% случаев и, следовательно, требует более повторить скважин.

Огромное количество данных, продолжительность жизни, порожденная этим анализ может быть использован для разработки эксперимента или штамма параметрической модели Гомпертца ^1. Эти Гомпертца модели полезны для определения мощности обнаружения и оценить количество ложных срабатываний и негативы для крупномасштабных экранов. Мы проверили предсказания этих моделей в слепой эксперименты и использовать их для оценки числа ложноотрицательных в больших экранов (неопубликованные результаты).

Таким образом, мы ожидаем, что представлены анализ будет иметь большое использовать для идентификации малых молекул, которые расширяют продолжительность жизни C.elegans и изучить основные механизмы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Calbiochem	cat# 171375	Also called Fungizone
FUDR	Sigma-Aldrich	cat# F0503	FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin	Sigma-Aldrich	M2525-250MG	Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine	Sigma-Aldrich	cat#C6022-MG	Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape	Nalge Nunc international	cat# 236370	Polyester, non-sterile
96 well plate	Falcon BD	cat# 351172	Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask	Nalge Nunc international	cat# 178883	used for large volumes