Live-изображений PKC транслокации в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов

Резюме

В этом видео, мы демонстрируем визуализации PKC транслокации в живых клеток с использованием флуоресцентной меткой PKCS.

Аннотация

Протеинкиназа Cs (PKCS) являются серин треонин киназы, которые играют центральную роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как рост клеток и обучения и памяти. Есть четыре известных семейств PKC изоформ у позвоночных животных: классический PKCS (α, Pi, βII и γ), новый тип я PKCS (ε и η), новый тип II PKCS (δ и θ), и атипичная PKCS (ζ и ι ). Классическая PKCS активируются Са ^{2 +} и diacylclycerol (DAG), в то время романа PKCS активируются DAG, но Са ^{2 +-независимой.} Атипичные PKCS активируются ни Са ^{2 +,} ни DAG. В Aplysia californica, наша модель системы для изучения формирования памяти Существуют три нервной системы конкретного PKC изоформы по одному от каждой основной класс, а именно: обычные PKC Apl я, новый тип я PKC Apl II и атипичных PKC Apl III. PKCS это липидные активированной киназы и, таким образом активация классического романа и PKCS в ответ на внеклеточные сигналы неоднократно коррелирует с РКС транслокация из цитоплазмы в плазматическую мембрану. Таким образом, визуализируя PKC транслокации в режиме реального времени в живых клетках стал бесценным инструментом для выяснения сигнальных путей, которые ведут к активации ПКС. Например, этот метод позволил нам установить, что различные изоформы PKC перемещать в различных условиях посредничество различных типа синаптической пластичности и серотонина (5НТ) активация PKC Apl II требует производства как DAG и фосфатидной кислоты (PA) для транслокация ^1-2. Важно отметить, что способность визуализировать же нейрон неоднократно позволило нам, например, для измерения десенсибилизации PKC ответ в изысканными деталями ^3. В этом видео, мы демонстрируем каждый шаг подготовки Sf9 клеточных культур, культур Aplysia сенсорные нейроны были описаны в другой видео статьи ^4, выражая флуоресцентно меткой PKCS в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов и жить-изображений PKC транслокации в ответ на различных активаторов использованием лазерной сканирующей микроскопии.

протокол

1. Подготовка и обслуживание Sf9 культурах клеток монослоя

1. Sf9 культуре клеток и техническое обслуживание выполняется в капот культуры ткани.
2. Sf9 клетки получены из Spodoptera frugiperda яичников клеток (Sf21 клеток) и могут быть приобретены как замороженные клетки в средствах массовой информации Грейс из Invitrogen.
3. Место 8 мл насекомых среду Грейс, дополненная (1X), к которому 30% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) была добавлена ​​в 75 см ² клеточной культуре колбу с наклонным шеи.
4. Оттепель замороженных трубки Sf9 клетки быстро в 37 ° С водяной бане, перемещая зонд вперед и назад (около 1-2 минут).
5. Передача Sf9 клетки 75 см ² ячейка колбу культуры и рок-пластинка аккуратно от руки, чтобы распространять клетки равномерно.
6. Инкубируют 1-2 часа при 27 ° С до клетки прилагается.
7. Удалить старые средние и заменить 10 мл насекомых среду freshGrace с 30% FBS.
8. Инкубировать при 27 ° С до клетки вырожденная.
9. Для поддержания монослоя культуры, удалить старые среды от сливной колбу Sf9 клеток и добавьте 5 мл насекомых среду Грейс с 10% FBS.
10. Слегка нажмите на стороне колбу несколько раз, чтобы отделить Sf9 клеток.
11. Использование 10 мл пипетки и пипетки, пипетка средств массовой информации вверх и вниз, когда-то нежно, опрыскивание стенке колбы пипеткой в ​​то время как вниз. Передача клетки стерильные 15 мл полистирола трубки.
12. Добавить 2 мл клеточной суспензии Sf9 до 8 мл насекомых среду Грейс с 10% FBS (1:5 разбавления для поддержания темпов роста логарифмической фазы) в новом 75 см ² ячейка колбу культуры и рок-пластинка аккуратно от руки.
13. Инкубировать при 27 ° С до клетки вырожденная.

2. Выражение флуоресцентно меткой PKCS в Sf9 Клетки

1. Для живого изображения эксперимент, культуры Sf9 клеток на 35 мм Маттек со стеклянным дном культуры disheswith поверхности стекла от 14 мм и толщина покровного 0,16 до 0,19 мм.
2. PKCS помеченные флуоресцентными белками выражаются в Sf9 клеток Cellfectin II трансфекции реагента следующие рекомендации производителя с изменениями, подробно описаны ниже.
3. День 1: Перед покрытием клетки, лечить каждое блюдо Маттек с насекомыми среду Грейс с 10% FBS, по крайней мере 30 минут.
4. Граф Sf9 клеток, начиная с шага 11 (выше), используя hemacytometer.
5. Пластина 0,05 х 10 ^{6 клеток} на каждом покровное Маттек стекла в общем объеме 150 мкл. Разрешить клетки приложить на 30 минут при комнатной температуре.
6. Добавить 2 мл Грейс с добавлением 10% FBS к каждому блюду 1 мл за один раз медленно, чтобы избежать отключения клеток.
7. Инкубировать при 27 ° С в течение ночи.
8. С этой точки зрения, использовать рекомендации производителя для трансфекции клеток с Sf9 плазмидной ДНК.
9. День 2: трансфекции клеток с Sf9 флуоресцентно меткой PKCS использованием Cellfectin II трансфекции реагента. Мы часто совместно выразили в этой системе PKCS с меткой расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) (детали для плазмиды строительство было описано выше ^2,5). Выражение одного флуоресцентного белка в то время, дает около 70-80% клеток, экспрессирующих 72 часов после трансфекции. Сотрудничество выражение из двух флуоресцентных белков снижает эффективность трансфекции примерно до 30% со-экспрессирующие клетки. Когда совместно выражения EGFP с метками РКС и mRFP с метками РКС, используйте 2 раза больше плазмидной ДНК для mRFP с метками белка для оптимальной экспрессии белка.
10. Живой концерт-визуализация 48-72 часов после трансфекции (для оптимальной экспрессии белка, подождите 72 часа).

3. Выражение флуоресцентно меткой PKCS в Aplysia сенсорных нейронов

1. Подготовка Aplysia нейронных культурах клеток было описано в статье видео Чжао и его коллеги ^4.
2. PKCS помеченные флуоресцентными белками выражаются в Aplysia сенсорных нейронов использованием микроинъекции процедуры подробно описаны ниже.
3. Подготовка исходного раствора 1% Быстрый зеленый (FCF) в дистиллированной воде, фильтр, используя шприц и 28 мм шприц фильтр (0,20 мкм). Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
4. Микроинъекции сенсорных нейронов может быть выполнена в день 1 или 2-й день после изоляции нейронов, но мы находим, что ожидание 2 дня позволяет лучше клетка соблюдение покровное.
5. На 2-й день после выделения сенсорных нейронов, оттепель аликвоту Быстрый зеленый и отфильтровать его снова с помощью шприца и 28 мм шприц фильтр (0,20 мкм).
6. Приготовьте раствор плазмидной ДНК в дистиллированной воде, содержащей 0,5% Быстрый Грин. Концентрации ДНК плазмиды достигает 0,4 мкг / мкл можно использовать, но это не рекомендуется, чтобы пойти выше этих значений.
7. Фильтры ДНК плазмиды / Быстро Зеленые решения с использованием 1 мл шприц и 4 мм, шприц фильтр (0,20 мкм).
8. Центрифуга ДНК плазмиды / Быстро Зеленый раствор при 16 110 мкг в течение 15 минут с помощью микрофонаrocentrifuge.
9. Подготовка резкое электродов для микроинъекции нейронов использованием микроэлектрода съемник (Саттер Flaming / коричневый микропипетки Puller, модель P-97). Использование окна нити, вытащить стекло микроэлектродов с 1 мм наружный диаметр, 0,75 мм в диаметре и длиной 100 мм с использованием тонких стен стеклянных капилляров с нитью внутри (Всемирный точных приборов TW100F-4). Дополнительные сведения о потянув микроинъекции электродов пожалуйста, обратитесь к Саттер поваренная книга электрода.
10. Заполните каждый электрод с 2 мкл ДНК плазмиды / Быстро Зеленые решения с использованием microloader пипетки (Eppendorf CA32950-050).
11. Передача нижней Маттек стекла культуры блюдо с Aplysia нейронных культур микроинъекции станции.
12. Микроинъекции Станция состоит из следующих действий: самодельная большой сцене стекла провести культуры блюда на стол виброизоляции (Kinetic вибрации Системы изоляции рабочей станции), стерео-рамки с наружного освещения галогенные, микроманипулятора (Саттер Хаксли настенного типа микроманипулятора которая позволяет не только грубые и ультра-точного позиционирования в трех-ось), микроэлектрода держатель подключен к пневматического насоса (инструменты Всемирного Precision PV820 пневматический Pico-насоса). Ввод давления пневматического насоса подключен к бак сжатым азотом.
13. Вставьте микроэлектрод в микроэлектрода держателя.
14. Просмотр в стерео-микроскопом, вставьте кончик микропипетки в клеточном ядре.
15. Доставить коротких импульсов давления азота (от 10 до 100 мс в срок; 20 фунт / ^2), пока ядро становится uniformely зеленый.
16. Инкубируйте клетки в течение 4 часов при комнатной температуре и хранить при температуре 4 ° С до использования. Для оптимального PKC транслокации, выступать с концертами-изображений эксперимента 20 - 24 часов после инъекции.

4. Визуализация PKC транслокации в живых Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов

1. Для обработки изображений, мы используем Zeiss LSM510 перевернутой конфокальной микроскопии с Axiovert 200.
2. Изображений протокол является одинаковым для Sf9 клеток и для Aplysia сенсорных нейронов, за исключением следующих: Sf9 клетки, полученную с использованием x63 цель погружения в то время как нефть Aplysia сенсорных нейронов, полученную с целью погружения нефть x40. Sf9 клетки отображается в контролируемой температурой камере поддерживается на уровне 26-27 ^° С, тогда как Aplysia сенсорных нейронов изображаются при комнатной температуре поддерживается около 18-20 ^° С.
3. Мы используем 30 мВт аргонового лазера (возбуждение при 488nm) с 50% излучения лазера на изображение РКС с меткой EGFP белка и лазерной HeNe (возбуждение при 543nm), чтобы изображение РКС с меткой белка mRFP. Аргон и гелий-неоновый лазер линии ослабляются до 4% и 50% передачи результатов соответственно до визуализации и отверстие настраивается на один.
4. Важно, чтобы культура блюдо стабилизировались на этапе визуализации и избежать движение или вибрацию.
5. Удалить 1 мл культуральной среды от блюдо аккуратно использованием 10 мл пипетки оставляя 1 мл общего объема в блюдо.
6. Снимайте в средней части клетки, где ядра можно увидеть.
7. Настройка временных рядов 10-20 конфокальных изображений съемки каждые 30 секунд.
8. Начало временных рядов.
9. После 2-х снимков (после 30 секунд момент времени), добавьте 1 мл препарата (2 раза концентрации) мягко капельный в верхней части клетки, используя P1000 пипетки. Препарат добавил непрерывно в течение приблизительно 30 секунд.
10. Некоторые препараты вызывают быстрое перемещение которых могут быть видны сразу после медикаментозного лечения (на 60 пунктов время секунд), а другие вызывают медленное перемещение которых только оптимальные 5-10 минут после лечения (Фильм 1 и Фильм 2).
11. Если препарат необходимо смыть с помощью 2 х 10 мл пипец сделать мыть, пипетки промывочный буфер мягко с одной пипетки с одной стороны от тарелки и pipeting до средств массовой информации, с другой стороны.
12. Если мыть была эффективной, и если эффект препарата является обратимым, РКС возвращается к цитозоля в течение 30-60 секунд.
13. Сохранить фильм как LSM файл.
14. Используйте NIH Image J программного обеспечения, чтобы открыть файлы LSM и количественно изображения до и после лечения препаратом. Количественное была описана в другом месте ^1.

Обсуждение

Мы описали технику изображения транслокации флуоресцентно меткой PKCS в реальном времени в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов. Sf9 клетки обеспечивают простую систему, чтобы изображение PKC транслокации с культивированием и трансфекции их довольно просто. В противоположность этому...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis