Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

Резюме

Virochip является пан-вирусных микрочипов предназначен для одновременного обнаружения всех известных вирусов, а также новыми вирусами на основе сохранения гомологии последовательности. Здесь показано, как запустить анализ Virochip для анализа клинических образцов на наличие известных и неизвестных вирусов.

Аннотация

Диагноз вирусного причины многих инфекционных заболеваний, трудно из-за присущего разнообразию последовательности вирусов, а также текущие появление новых вирусных патогенов, таких как атипичная пневмония коронавирус и 2009 пандемии вирус гриппа H1N1, которые не обнаруживаются традиционными методами. Для решения этих задач, мы уже разработаны и утверждены пан-вирусных микрочипов платформу под названием Virochip со способностью обнаруживать все известные вирусы, а также новые варианты на основе сохранения гомологии последовательности ^1. Использование Virochip, мы определили весь спектр вирусов связано с респираторными инфекциями, в том числе случаи необъяснимых критических заболеваний у госпитализированных пациентов, при этом чувствительность равна или превосходит обычные клинические ^2-5 тестирования. Virochip также используется для выявления новых вирусов, в том числе ОРВИ коронавирус ^6,7, роман клады риновирусов ^5, XMRV (ретровирус, связанных с раком предстательной железы) ^8, птичий bornavirus (причина изнуряющая болезнь у попугаев) ^9, и роман cardiovirus у детей с респираторными и желудочно-кишечные заболевания ^10. Текущая версия Virochip была портирована на платформу Agilent микрочипов и состоит из ~ 36000 зондов производным от более чем ~ 1500 вирусов в GenBank по состоянию на декабрь 2009 года. Здесь мы показываем, этапы обработки анализа Virochip от начала до конца (~ 24 час времени оборота), в том числе образцы нуклеиновых кислот, ПЦР-амплификации с использованием случайных праймеров, флуоресцентный краситель регистрации, и микрочипов гибридизации, сканирование и анализ.

протокол

Шаги анализа Virochip включают (1) нуклеиновых кислот из клинических образцов, (2) обратную транскрипцию добываемого РНК и ^2-го цепи кДНК синтеза, (3) ПЦР-амплификации кДНК случайно загрунтовать, (3) Cy3 флуоресцентных красителей включение , (4) гибридизации меченого материала Virochip микрочипов, и (5) сканирование и анализ (рис. 1). Протокол показано ниже продемонстрирует использование анализа Virochip на образце назальный мазок из ребенка с гриппоподобным заболеванием.

Грунтовка Последовательности

Грунтовка 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N ₉₎ -3 '

Грунтовка В 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '

1. Нуклеиновых кислот

1. Выделения нуклеиновых кислот из клинических образцов должны быть выполнены в соответствии Уровень биологической безопасности 2 (BSL-2) или выше условий, так как эти образцы являются потенциально заразными.
2. Образец назальный мазок транспортируется в вирусной среде холдинга. Алиготе 200 мкл образца в 1,5 мл трубки микроцентрифужных Эппендорф.
3. Дополнительно: пройти пробы через фильтр 0,22 мкм (для очистки вирусных частиц)
4. Дополнительно: предварительной обработки образца с ДНКазы (деградировать ДНК хост геномных и очистить для защищенных, encapsidated вирусной нуклеиновой кислоты) с использованием Turbo ДНКазы комплект (Амбион) в соответствии с инструкциями производителя
5. Извлечение примера с использованием Zymo ZR Вирусная РНК Добыча Kit или Qiagen Ultrasens Virus Kit в соответствии с инструкциями производителя.

2. Обратная транскрипция и ^{2-й-цепи} кДНК синтеза ("Круглый")

1. Добавить 1 мкл 40 пмоль / мкл праймера до 4 мкл извлеченные РНК. Нагреть до 65 ° С в течение 5 мин в амплификаторе (например GeneAmp PCR System 9700), а затем дать остыть при комнатной температуре х 5 мин.
2. Добавьте 5 мкл мастер смесь, состоящую из 2 мкл 5X буфера РТ, 1 мкл 12,5 мМ дНТФ, 1 мкл воды, 0,5 мкл 0,1 М ДТТ, и 0,5 мкл SSIII РТ (Invitrogen). Инкубировать при 42 ° С х 60 минут.
3. В программируемых амплификаторе, тепла до 94 ° С х 2 мин (для отмены обратной реакции транскриптазы), охладить до 10 ° С, пульс центрифуге, а затем добавить 5 мкл смеси Sequenase, состоящий из 1 мкл 5X буфера Sequenase, 3,8 мкл воды, и 0,15 мкл Sequenase (USB Corporation). Для ^2-го синтеза нити, нарастить от 10 ° C до 37 ° С в течение 8 мин, проведение 8 мин, затем тепло до 94 ° С х 2 мин (для инактивации Sequenase) и охладить до 10 ° C (удержание).
4. Дополнительно: Rd образец кДНК можно хранить в этом месте при температуре -20 ° C.

3. ПЦР-амплификации кДНК Случайно грунтовкой ("Круглый B")

1. Добавьте 5 мкл Rd образца 45 мкл мастер смесь, состоящую из 5 мкл 10х буфера ПЦР, 1 мкл 12,5 мМ дНТФ, 1 мкл 100 пмоль / мкл праймера B, 1 мкл KlenTaq Л.А. (Sigma), и 37 мкл воды.
2. Выполнить ПЦР протокола следующим образом: 94 ° C, 2 мин → (25 циклов 94 ° С, 30 сек / 50 ° С, 45 сек / 72 ° С, 1 мин) → 72 ° С, 5 мин → 10 ° C ( удерживайте)
3. Проверка образца Rd В на 1,5% агарозном гель-электрофореза. Мазок из примерно 200 - 1000 б.п. следует визуализировать (рис. 2А)

4. Cy3 флуоресцентная краска регистрации

1. Дополнительно: еще один образец может быть помечены флуоресцентным красителем Cy5 и гибридизовали к тому же микрочипов.
2. Чтобы включить аа-дНТФ, добавляют 5 мкл образца Rd B до 45 мкл мастер смесь, состоящую из 5 мкл 10х буфера ПЦР, 1 мкл 12,5 мМ аа-дНТФ (Invitrogen), 1 мкл 100 пмоль / мкл праймера B, 1, 1 мкл KlenTaq Л.А. (Sigma), и 37 мкл воды. Выполнить ПЦР протокола следующим образом: 94 ° C, 2 мин → (15 циклов 94 ° С, 30 сек / 50 ° С, 45 сек / 72 ° С, 1 мин) → 72 ° С, 5 мин → 10 ° C ( удерживайте)
3. Чистый образец Rd C с ДНК Чистота и концентратор-5 Kit (Zymo исследований) в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 10 мкл.
4. Добавить 1 мкл 1М бикарбоната (Sigma) и 1 мкл Cy5 (GE Healthcare) к образцу Rd C.
5. Инкубируйте х 1 час в темноте.
6. Чистая Cy3 меченных образца с ДНК Чистота и концентратор-5 Kit (Zymo исследований) в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 12 мкл.

5. Гибридизация с Virochip Microarray

1. Дополнительно: использование 1,5 мкл кДНК и проверить концентрацию и количество красителя зарегистрирована Nanodrop спектрофотометр (для нормализации образцов)
2. В трубке полосу ПЦР добавить 1 мкл 25X буфера фрагментации, 5 мкл 5X блокирующего буфера, 9,5 мкл (или количество нормализовать) из Cy3 меченных образца, и воду, чтобы общий объем 25 мкл (Agilent)
3. Добавьте 25 мкл 2X гибридизации GEx буфера (Agilent). Спином вниз кратко, чтобы удалить пузырьки.
4. Нагрузка 40 мкл образца на слайд прокладкой.
5. Место Agilent отпечатанных Virochip массив (Университет Californi, Сан-Франциско / Agilent) (сторона с маркировкой "Agilent" вниз) в верхней части слайда прокладку и закрепите винтом плотно.
6. Гибридизации на ночь в 65 ° С духовке, настройки скорости в 10 оборотов в минуту.
7. Для мытья массивы, разогрейте буфера 2 (Agilent) до 37 ° C. Возьмите, кроме прокладки слайд / массив подводных сэндвич в буфере 1 (Agilent). Стирать в буфер 1 х 1 мин. Стирать в разогретой буфера 2 х 1 мин. Медленно снимите слайд из буфера 2, соблюдая осторожность, чтобы избежать пузырей (используется для kimwipe фитиль от излишней влаги будьте осторожны, чтобы избежать непосредственно трогательные активной стороне массива)
8. Место слайд в слайд-держатель и вставить в массив сканера.

6. Virochip Сканирование и анализ

1. Сканирование Cy3 меченных массива в 5 мкм и 2 мкм в соответствии со стандартом протокола сканирования инструмента (рис. 2В).
2. Анализ Virochip микрочипов при визуальном осмотре, кластерный анализ, или автоматизированный анализ Virochip программы, E-Предсказать ^11. По каждому из этих трех методов, вирус гриппа легко обнаружить в образце назальный мазок (от ребенка с гриппоподобным заболеванием) (рис. 2C)

7. Представитель Результаты:

Когда протокол все сделано правильно, мазок должен быть замечен на электрофореза в агарозном геле после шагом Rd B (рис. 2А). Virochip микрочипов на платформе Agilent будет трудно проанализировать визуально (рис. 2Б), но если вирус присутствует оно должно быть легко определить при визуальном осмотре, кластерный анализ, и / или E-Predict (рис. 1в). Образцы могут подсыпали измеряемых величин нуклеиновой кислоты из известных вирусов (например, вирус табачной мозаики; MS2 бактериофаг) в качестве положительного контроля для анализа.

Рисунок 1. Схема Virochip микрочипов обработки и анализа. Извлеченные нуклеиновых кислот из клинических образцов случайным усиливается, меченные флуоресцентными красителями и гибридизации с Virochip микрочипов. Microarrays сканируются на 2 мкм разрешение и проанализированы с помощью различных вычислительных средств, в том числе E-Predict.

Рисунок 2. Этапы анализа Virochip После усиления случайных ПЦР, мазок 200 -. 1000 б.п. могут быть визуализированы помощью гель-электрофореза (A) (B) Три Virochip микрочипов из 8 массивов / стекло слайде показано, с малой области. одного микрочипов раздутых на вставке в нижнем правом углу. (С) Автоматизированная микрочипов вирусного анализа с использованием E-Предсказать выявления наличия вируса гриппа А в клинической пробе. Высокий показатель сходства (S = 0,55) соответствует р-значение, близкое к нулю, что делает это чрезвычайно важным предсказанием.

Обсуждение

Virochip протокол, как описано здесь является сложным и требует тщательного и квалифицированного исследования техник. Правильная концентрация реагента и условий для ПЦР, маркировки и гибридизации являются критическими. Протокол Virochip могут быть легко изменены, чтобы приспособить анализа больные ткани с использованием метода извлечения ткани, такие как TRIzol (Invitrogen) для выделения нуклеиновых кислот. Зонды могут быть добавлены или удалены, сколько необходимо для получения желаемого спектра и широта охвата, например, зонды для обнаружения невирусные целей, таких как бактерии и грибки могут быть разработаны и добавил, "на лету". Некоторые приложения анализа Virochip в настоящее время в стадии разработки включают широкий спектр вирусных диагностики в клинической лаборатории, расследования вспышек, чистота скрининга лекарственных препаратов и вакцин, и новые вирусные открытия возбудителя.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / материал	Название реагента / материал
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 '
Грунтовка B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Master Mix (5 мкл)	2 мкл 5X буфера РТ
	1 мкл 12,5 мМ дНТФ (Invitrogen)
	1 мкл воды
	0,5 мкл 0,1 М ДТТ
	0,5 мкл SSIII РТ (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 мкл)	1 мкл 5X буфера Sequenase
	3,8 мкл воды
	0,15 мкл Sequenase (USB корпорация)
Rd B ПЦР Master Mix (45 мкл)	5 мкл 10х буфера ПЦР
	1 мкл 12,5 мМ дНТФ (Invitrogen)
	1 мкл 100 пмоль / мкл праймера B
	1 мкл KlenTaq Л.А. (Sigma)
	37 мкл воды
Rd C PCR Master Mix (45 мкл)	5 мкл 10х буфера ПЦР
	1 мкл 12,5 мМ дНТФ (Invitrogen)
	1 мкл 100 пмоль / мкл праймера B
	1 мкл KlenTaq Л.А. (Sigma)
	37 мкл воды
Гибридизация буфера (25 мкл)	1 мкл 25X буфера фрагментации (Agilent)
	5 мкл 5X блокирующего буфера (Agilent)
	9,5 мкл (или количество нормализовать) из Cy3 меченных образца
	Добавьте воды до общего объема 25 мкл
Agilent Virochip микрочипов	лицензии в ожидании, можно получить Чиу лаборатории, UCSF