Method Article
Способ изучения интеграции новорожденных зубчатой ЗК у взрослых животных описывается. Эта техника использует инженерии ретровируса маркировать новорожденных нейронов, а затем электрофизиологические записи, чтобы определить в естественных условиях функциональной интеграции.
Нейрогенез происходит у взрослых млекопитающих мозги в суб-желудочковой зоны (СВЗ) бокового желудочка и в суб-зернистый зоны (SGZ) в зубчатой извилине гиппокампа в течение всей жизни. Предыдущие отчеты показали, что взрослые гиппокампа нейрогенеза связана с различными расстройствами мозга, в том числе эпилепсия, шизофрения, депрессия и тревога (1). Расшифровка процесс нормальный и аберрантных взрослых родился нейрона интеграции, может пролить свет на этиологию этих заболеваний и учтены при разработке новых методов лечения.
SGZ взрослого нейрогенеза зеркала эмбриональное и послеродовое развитие нейронов, в том числе этапы судьбы спецификации, миграция, синаптической интеграции и созревание. Тем не менее, полная интеграция происходит в течение длительного, 6-недельный период. Первоначальные синаптической вход взрослым родился SGZ зубчатой ЗК (РСК) является ГАМК, а затем глутаматергической вход через 14 дней (2). Специфические факторы, которые регулируют схема образования взрослых родился нейронов в зубчатой извилине в настоящее время неизвестны.
Наша лаборатория использует репликацию с дефицитом ретровирусные вектора на основе Молони мышиного вируса лейкемии доставить флуоресцентных белков и предположили регуляторных генов этих пролиферирующих клеток. Это вирусная технология обеспечивает высокую специфичность и разрешение для проведения анализа клеточных дата рождения, происхождение, морфологии и синаптогенез.
Типичном эксперименте часто используют два или три вирусов содержащие уникальный лейбл, трансгенов, и промоутер элементы для одноклеточных анализ желаемого процесса развития в естественных условиях. Следующий протокол описывает метод анализа функциональной интеграции новорожденных нейронов с помощью одного зеленого (GFP) или красный (dTomato) флуоресцентного белка ретровируса и патч-зажим электрофизиологии.
1. Вирус инъекций
Высокого титра инженерии ретровируса (1 × 10 9 ед / мл) производится котрансфекцию ретровирусных векторов и VSVG в HEK293T клетки, а затем ультрацентрифугирования вирусного супернатанта. Для источников и методов производства, см. в превосходной демонстрацией Юпитер (3).
Примечание: молодые взрослые (4-6 недель) женщина C57Bl / 6 мышей (Charles River) размещаются в стандартных условиях. Все процедуры следуют Руководство Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных под протоколом утвержденным Stony Brook University IACUC.
2. Подготовка фрагментов
Для получения высококачественных острых ломтики от взрослых мышей, мы используем модифицированный резки решение для среза подготовки (см. ниже).
3. Электрофизиологические эксперименты
4. Анализ данных
Амплитуды вызвала постсинаптические ответы анализируются на разных стадиях развития взрослого родился нейронов.
5. Представитель Результаты
Использование протокола выше, GFP выражение у новорожденных нейронов зубчатой извилины как на рисунке 1 является распространенным явлением. Обратите внимание, что новорожденного нейроны легко визуализировать и оба дендритов и аксонов таких стратегий прочно маркированы. Выражение в тонких ДГК аксонов и малых шипов зависит от качества и титр вируса, промоутер используются и длиной в живом выражении. В наших руках, новорожденных клеток и субклеточных органелл, как правило, видимых в течение нескольких дней после инъекции, и позвоночник выражение может быть прослежена от самых ранних стадиях развития. Wотверстие-клеточной записи с новорожденным нейронов на разных этапах времени позволяют изучения уникальных свойств новорожденных клетки, например, потенциалы действия (рис. 2а), а также процесс синаптической интеграции в существующие нейронные цепи во время созревания (рис. 2б).
Рис 1 2-фотон конфокальной образ новорожденных нейронов в горизонтальной зубчатой извилине разделе взрослой мыши. Зеленые клетки 21dpi (дней после инъекции) GFP-экспрессирующих новорожденных РСК помечены pUX-GFP ретровируса.
Рисунок 2) потенциал действия стрельбы свойства новорожденных DGC в 21 точек на дюйм. Б) представителя вызвала возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs), записанной на новорожденного DGC в 21 точек на дюйм.
Непрерывная нейрогенез в гиппокампе взрослых млекопитающих мозг дает уникальную экспериментальную систему моделью для изучения нейронных развития и интеграции в зрелом мозге. Протокол, представленные здесь сочетаются ретровирусных маркировки и электрофизиологических методов исследования интеграции новорожденных нейронов зубчатой гранул в мозге взрослых мышей.
Чтобы убедиться, что ваши эксперименты пройдут успешно, мы рекомендуем следующие в критические этапы процедуры:
Чтобы избежать нежелательных инфекций и воспалений, все инструменты должны быть стерилизованы (автоклавированием, любой тип стерилизатор, или 70% этанола) до операции. Используйте стерильные PBS мыть кончике иглы шприца перед инъекцией.
Для вируса инъекции, животные должны быть хорошо установлен на стереотаксического устройства и источники лишних движений должны быть сведены к минимуму во время инъекции. Убедитесь, что голова хорошо фиксированной и фирмы, а также настроить нос положение мыши на уровень брегмы и лямбда до расчета координат инъекции. Извлечение вирус в шприце быстро, чтобы минимизировать воздействие до комнатной температуры - ретровирусы, которые особенно чувствительны к перепадам температур. Inject вирус медленно рекомендуемая скорость, чтобы минимизировать давление повреждения. Использование рекомендованных плоским наконечником шприца (по сравнению с общим скошенным кончиком) обеспечит равномерно распределяется зубчатой извилине области инфекции.
Перед приготовлением ломтиками, резка решение и инкубации ACSF должны быть клокотало с 95% O 2 -5% CO 2 в течение 30 минут, чтобы насытить кислородом решений. Животные должны быть быстро и перфузии тканей поддерживаться в холодном, кислородно-насыщенный раствор для лучшего среза качества.
Для регистрации, увеличение интенсивности раздражения постепенно, пока не будет постсинаптического ответа. Изменение расположения стимуляции электродов в молекулярном слое зубчатой извилины по мере необходимости.
Таким образом, рекомендуемый подход предлагает способ для изучения различных свойств и возможных функциональных ролей взрослого родился нейронов во время ранней стадии интеграции в активной, зрелой схемы.
Эта работа финансировалась NINDS и Американской ассоциации сердца к S.Ge. Этот подход был изначально создан и разработан автором в лаборатории доктора Хунцзюнь песни в Университете Джона Хопкинса. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Хунцзюнь Песня для его руководство и поддержку.
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены