Изучение интеграции взрослых происхождения Нейроны

Резюме

Способ изучения интеграции новорожденных зубчатой ​​ЗК у взрослых животных описывается. Эта техника использует инженерии ретровируса маркировать новорожденных нейронов, а затем электрофизиологические записи, чтобы определить в естественных условиях функциональной интеграции.

Аннотация

Нейрогенез происходит у взрослых млекопитающих мозги в суб-желудочковой зоны (СВЗ) бокового желудочка и в суб-зернистый зоны (SGZ) в зубчатой ​​извилине гиппокампа в течение всей жизни. Предыдущие отчеты показали, что взрослые гиппокампа нейрогенеза связана с различными расстройствами мозга, в том числе эпилепсия, шизофрения, депрессия и тревога (1). Расшифровка процесс нормальный и аберрантных взрослых родился нейрона интеграции, может пролить свет на этиологию этих заболеваний и учтены при разработке новых методов лечения.

SGZ взрослого нейрогенеза зеркала эмбриональное и послеродовое развитие нейронов, в том числе этапы судьбы спецификации, миграция, синаптической интеграции и созревание. Тем не менее, полная интеграция происходит в течение длительного, 6-недельный период. Первоначальные синаптической вход взрослым родился SGZ зубчатой ​​ЗК (РСК) является ГАМК, а затем глутаматергической вход через 14 дней (2). Специфические факторы, которые регулируют схема образования взрослых родился нейронов в зубчатой ​​извилине в настоящее время неизвестны.

Наша лаборатория использует репликацию с дефицитом ретровирусные вектора на основе Молони мышиного вируса лейкемии доставить флуоресцентных белков и предположили регуляторных генов этих пролиферирующих клеток. Это вирусная технология обеспечивает высокую специфичность и разрешение для проведения анализа клеточных дата рождения, происхождение, морфологии и синаптогенез.

Типичном эксперименте часто используют два или три вирусов содержащие уникальный лейбл, трансгенов, и промоутер элементы для одноклеточных анализ желаемого процесса развития в естественных условиях. Следующий протокол описывает метод анализа функциональной интеграции новорожденных нейронов с помощью одного зеленого (GFP) или красный (dTomato) флуоресцентного белка ретровируса и патч-зажим электрофизиологии.

протокол

1. Вирус инъекций

Высокого титра инженерии ретровируса (1 × 10 ⁹ ед / мл) производится котрансфекцию ретровирусных векторов и VSVG в HEK293T клетки, а затем ультрацентрифугирования вирусного супернатанта. Для источников и методов производства, см. в превосходной демонстрацией Юпитер (3).

Примечание: молодые взрослые (4-6 недель) женщина C57Bl / 6 мышей (Charles River) размещаются в стандартных условиях. Все процедуры следуют Руководство Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных под протоколом утвержденным Stony Brook University IACUC.

1. Оттепель 2UL замороженных ретровируса на одно животное на льду.
2. Анестезировать (100 мкг кетамин + 10 мкг на грамм ксилазина массы тела) и смонтировать животное на стереотаксической рамы (Steolting). Удаление волос на голове и протирать кожу 70% этанола.
3. Expose черепа и просверлите четыре отверстия мелкой использования бормашины (0,6 мм сверло) по следующим координатам:
   • anterioposterior = -2 мм от брегмы, боковые = ± 1,6 мм, нижний = 2,5 мм; anterioposterior = -3 мм от брегмы, боковые = ± 2,6 мм, нижний = 3,2 мм.
   • anterioposterior = -2 мм от брегмы, боковые = ± 1,6 мм, нижний = 2,5 мм; anterioposterior = -3 мм от брегмы, боковые = ± 2,6 мм, нижний = 3,2 мм.
4. Горы 1 мкл Hamilton, телевизор с плоским наконечником шприца и вводят 0,5 мкл ретровируса на участок в размере 0,25 мкл / мин в зубчатой ​​извилине. (См. выше координаты вентральной глубину.) Пауза 2 минуты после каждой инъекции перед медленно снятии шприца для предотвращения обратного потока жидкости. Между инъекциями, кратко ополосните внешнюю поверхность наконечника шприца стерильной PBS и аппликатор для удаления следов крови.
5. Закрыть рану стерильным хирургический шовный материал (тип П-1; Размер 6-0) и вернуть животное к стандартным условиям жилья до нужного времени этапах после инъекции.

2. Подготовка фрагментов

Для получения высококачественных острых ломтики от взрослых мышей, мы используем модифицированный резки решение для среза подготовки (см. ниже).

1. Предварительное охлаждение режущего решение до 0-4 ° С на льду и пузырь с 95% O ₂ -5% CO ₂ в течение 30 минут.
2. Анестезировать и transcardially заливать животное с ледяной насыщенных кислородом резки решение.
3. Быстро удалить мозг в Петри-блюдо с фильтровальной бумаги предварительно смоченную холодной, насыщенной кислородом резки решение. Отрежьте мозжечка и нарезать монтажной поверхности не менее 1 мм впереди (видимый) введение координат. Клей мозга на стадии vibrotome и смонтировать его в камеру дробления заполнена холодной и кислородом резки решение.
4. Подготовка корональной или горизонтальных ломтиков (300-350μm) и передавать их с большого диаметра пипетки на камеру, содержащую инкубации при комнатной температуре ACSF пузырилась с 95% O ₂ / 5% СО _2.
5. Инкубируйте ломтиками, бурлящие непрерывно, при 32 ° С в течение 30-60 минут. Вернуться камере до комнатной температуры в течение всего срока регистрации.

3. Электрофизиологические эксперименты

1. Фрагменты передаются в записи камеру, которая постоянно озарен насыщенных кислородом ACSF при 32 ° C - 34 ° C.
2. Стимуляции биполярного вольфрамовый электрод помещается в молекулярном слое зубчатой ​​извилины использованием низких микрообъектива увеличением (10х).
3. Новорожденные РСК в суб-зернистый зоны / зернистого слоя ячейки обозначаются выражением GFP или dTomato. Всего-клеточные patchclamp запись выполняется на новорожденных нейронов при большом увеличении (40х).
4. Стрельба свойства записаны клетки получаются путем введения ряда течений в соответствии с действующим зажим режиме.
5. Электрические стимулы доставляются стимуляции электрод через стимуляцию изолятор контролируется программное обеспечение для записи, и вызвала постсинаптических токов в РСК новорожденных регистрируются.

4. Анализ данных

Амплитуды вызвала постсинаптические ответы анализируются на разных стадиях развития взрослого родился нейронов.

5. Представитель Результаты

Использование протокола выше, GFP выражение у новорожденных нейронов зубчатой ​​извилины как на рисунке 1 является распространенным явлением. Обратите внимание, что новорожденного нейроны легко визуализировать и оба дендритов и аксонов таких стратегий прочно маркированы. Выражение в тонких ДГК аксонов и малых шипов зависит от качества и титр вируса, промоутер используются и длиной в живом выражении. В наших руках, новорожденных клеток и субклеточных органелл, как правило, видимых в течение нескольких дней после инъекции, и позвоночник выражение может быть прослежена от самых ранних стадиях развития. Wотверстие-клеточной записи с новорожденным нейронов на разных этапах времени позволяют изучения уникальных свойств новорожденных клетки, например, потенциалы действия (рис. 2а), а также процесс синаптической интеграции в существующие нейронные цепи во время созревания (рис. 2б).

Рис 1 2-фотон конфокальной образ новорожденных нейронов в горизонтальной зубчатой ​​извилине разделе взрослой мыши. Зеленые клетки 21dpi (дней после инъекции) GFP-экспрессирующих новорожденных РСК помечены pUX-GFP ретровируса.

Рисунок 2) потенциал действия стрельбы свойства новорожденных DGC в 21 точек на дюйм. Б) представителя вызвала возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs), записанной на новорожденного DGC в 21 точек на дюйм.

Обсуждение

Непрерывная нейрогенез в гиппокампе взрослых млекопитающих мозг дает уникальную экспериментальную систему моделью для изучения нейронных развития и интеграции в зрелом мозге. Протокол, представленные здесь сочетаются ретровирусных маркировки и электрофизиологических методов исследования интеграции новорожденных нейронов зубчатой ​​гранул в мозге взрослых мышей.

Чтобы убедиться, что ваши эксперименты пройдут успешно, мы рекомендуем следующие в критические этапы процедуры:

Чтобы избежать нежелательных инфекций и воспалений, все инструменты должны быть стерилизованы (автоклавированием, любой тип стерилизатор, или 70% этанола) до операции. Используйте стерильные PBS мыть кончике иглы шприца перед инъекцией.

Для вируса инъекции, животные должны быть хорошо установлен на стереотаксического устройства и источники лишних движений должны быть сведены к минимуму во время инъекции. Убедитесь, что голова хорошо фиксированной и фирмы, а также настроить нос положение мыши на уровень брегмы и лямбда до расчета координат инъекции. Извлечение вирус в шприце быстро, чтобы минимизировать воздействие до комнатной температуры - ретровирусы, которые особенно чувствительны к перепадам температур. Inject вирус медленно рекомендуемая скорость, чтобы минимизировать давление повреждения. Использование рекомендованных плоским наконечником шприца (по сравнению с общим скошенным кончиком) обеспечит равномерно распределяется зубчатой ​​извилине области инфекции.

Перед приготовлением ломтиками, резка решение и инкубации ACSF должны быть клокотало с 95% O ₂ -5% CO ₂ в течение 30 минут, чтобы насытить кислородом решений. Животные должны быть быстро и перфузии тканей поддерживаться в холодном, кислородно-насыщенный раствор для лучшего среза качества.

Для регистрации, увеличение интенсивности раздражения постепенно, пока не будет постсинаптического ответа. Изменение расположения стимуляции электродов в молекулярном слое зубчатой ​​извилины по мере необходимости.

Таким образом, рекомендуемый подход предлагает способ для изучения различных свойств и возможных функциональных ролей взрослого родился нейронов во время ранней стадии интеграции в активной, зрелой схемы.

Материалы