Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Резюме

Демонстрация изготовления и использования внеклеточных электродов всасывания используется для измерения электрофизиологических записей новорожденных грызунов спинного мозга В пробирке

Аннотация

Развитие нейронных схемотехника и передвижения могут быть изучены с помощью новорожденных грызунов спинного мозга центральной картины генератора (CPG) поведение. Мы демонстрируем метод для изготовления электродов всасывания, которые используются для изучения CPG деятельности, или фиктивной локомоции, в расчлененное грызунов спинного мозга. Грызун спинного мозга находятся в искусственной спинномозговой жидкости и вентральных корешков втягиваются в всасывающего электрода. Электрода построен путем изменения имеющихся в продаже всасывания электрода. Тяжелее серебряной проволоки используется вместо стандартной проволоки дается коммерчески доступных электрода. Стеклянным наконечником на коммерческой электрод заменен пластмассовым наконечником для увеличения долговечности. Мы готовим рисованной электроды и электроды из конкретных размеров трубки, что позволяет согласованность и воспроизводимость. Данные собраны при помощи усилителя и программного обеспечения neurogram приобретения. Записи выполняются на стол воздуха внутри клетки Фарадея для предотвращения механических и электрических помех, соответственно.

протокол

Электрофизиологические записи изолированных спинного мозга может выявить генетические и развития изменений в нервной системы ^1. Ранее мы показали метод препарировать новорожденных мышей спинной мозг ^2. Здесь мы представляем метод подготовки всасывания полезных электродов в записи фиктивного передвижения в изолированных спинного мозга ^3.

Кончик электрода пластиковые трубы может быть обращено на очень тонкой наконечником вручную с помощью низкотемпературной спиртовки ^3-5. Пластиковые трубы (PE90, Клей Адамс Intramedic ^TM) проходит над пламенем, чтобы смягчить трубку в податливый форме. Как трубка начинает таять и становится более прозрачным он удаляется от источника тепла и концы аккуратно вытащил друг от друга. Сроки удаления трубки из пламени важно, чтобы застраховать пластик не свернуть или раскол в то же время выводы. Тонкая часть трубки разрезают бритвой в зависимости от желаемого внутреннего диаметра, как это диктуется возраст образца или сегментарного уровня мозга. Для удобства размещения уплотнительного кольца на трубу, 45 ° надрез на толстый конец трубки с лезвием бритвы. Наконечником и уплотнительные кольца установлены на толстый конец приложите электрод к стволу электрода.

Для того чтобы учесть в частности размера электродов и избежать трудностей, ручной потянув электрода советы, электроды могут быть построены с использованием малых трубки вставляется в толще трубки (PE90). Длины трубы являются специфическими для требований настройки записи и переменной. Мы представляем измерений, используемых в наших экспериментах ^1-3,5. 1 см длины PTFE тонкая трубка (Зевс, мелкие детали) и 10 см длиной PE90 трубки разрезают бритвой. Концы небольшие трубки должны быть рассмотрены с целью убедиться, что они не задавить или закрыты. Они могут быть открыты с помощью насекомых контактный (Fine Инструменты наук). Каплю клея (JB Weld) помещается на середину трубки PTFE. Трубки из тефлона и клей втягиваются в PE90 трубки использованием рот всасывание на PE90 труб. 45 ° надрез на толстом конце трубки и наконечника и уплотнительное кольцо соединены, как и предыдущие.

Наконечником и BNC разъема отвинтил от коммерческих электрода всасывания. Разъем BNC замачивают в ксилоле в течение одного часа, чтобы удалить сургучной печати. Разъем затем промыть в воде и сушат.

Нижний угловой левого борта должны быть сделаны на стороне ствола. Металлический стержень нагревается использования горелки Бунзена и прессуют в существующие отверстия на боковой стороне ствола под небольшим углом. 15 см длиной 0,010 дюйма серебряной проволоки (AM Systems) разрезают и вымачивают в отбеливателя в течение пятнадцати минут. Это сделано, чтобы создать серебряное покрытие хлорид, который помогает в проведении сигнала ^6. Проволокой промывают водой, сушат, а затем припаяны BNC разъем. BNC-разъемами и серебра вставляются в ствол всасывания электрод с достаточно места для BNC разъем оставаться в стороне от ствола. Всасывающая трубка вставляется в сторону порта 2-3см. Силиконовый герметик вводят в ствол примерно на 2-3см. BNC разъем с резьбой в ствол электрод нажатием герметик вперед.

Кончик электрода теперь вкручивается в передней части электрода. Термоусадочная трубка также может быть добавлен к укреплению линии всасывания со стороны порта.

Электроды крепятся на микроманипуляторами, которые прикреплены к магнитной стоит, и поместил рядом с записью блюдо. BNC коаксиальных кабелей крепятся к headstage, который подключен к усилителю. Усилитель подключен к адаптеру (PolyView), который подключен к аналоговой к цифровой карте (National Instruments) в компьютер с ПО для сбора данных (PolyView).

При записи электрофизиологических данных, необходимо устранить все вмешательства извне. Запись блюдо, усилитель, и глава этапе размещаются на стол воздуха внутри клетки Фарадея для предотвращения электрических и механических помех, соответственно.

Представитель Результаты:

Рисунок 1. Коммерчески доступных всасывания электрода может быть изменен путем добавления тяжелее проволока серебро и пластмассовым наконечником, который стороны обращено на спиртовке, или построенных с имеющимися в продаже пластиковые трубы конкретных размеров. Кроме того, парафин герметик заменена на более долговечный герметик силиконовый конопатить.

Рисунок 2. Схема всасывающего электрода по отношению к таблице воздуха (для механической изоляции), клетка Фарадея (электрически isolatiп.), усилитель и компьютер. Следует отметить, что есть основание ссылки на блюдо записи и второе основание, на которое ссылается на таблицу воздуха и клетки Фарадея.

Обсуждение

Нервная система развития могут быть изучены с помощью изолированного спинного мозга грызунов. В присутствии медиаторов, фиктивный передвижения могут быть сгенерированы из спинного мозга в виде узорной электрической активности ^1,3. Эти ритмичные очередей производятся на 0,2 до 0,5 ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing)	Zeus	36AWG	0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006”
Large tubing (0.86mm (0.34”))	BD Biosciences	427420	0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”)
Electrode Barrel	A-M Systems	573000
Adhesive	JB Weld
Adhesive: Silicone caulk
Solder and soldering iron
Bleach
Xylene
Silver wire: 0.010”	A-M Systems
Insect pins: Austerlitz 0.1mm	Fine Science Tools	26002-10
Magnetic Stand	Narishige International	GJ-8
Micromanipulator	Narishige International	MN 151
Miniboard (Headstage)	Grass Technologies	F-15EB/B1
Polyview Adaptor Unit	Grass Technologies	PVA 8
Bipolar Portable Physiodata Amplifier System	Grass Technologies	15LT
ANALOG TO DIGITAL CARD	National Instruments	6035E
Air Table; Vibraplane	Kinetic Systems