Сосредоточены ионного пучка фрезерные и сканирующей электронной микроскопии ткани мозга

Резюме

Этот протокол описывает, как смола встроенных мозговой ткани могут быть подготовлены и отображается в трех измерениях сосредоточены ионного пучка, сканирующего электронного микроскопа.

Аннотация

Этот протокол описывает, как биологические образцы, такие как ткани мозга, могут быть отображены в трех измерениях, используя сосредоточены ионного пучка / сканирующем электронном микроскопе (FIB / SEM). Образцы крепятся с помощью альдегидов, тяжелых металлов использованием окрашенных четырехокиси осмия и уранилацетата. Затем они обезвоженной с алкоголем и проникли со смолой, которая затем затвердела. Использование светового микроскопа и ультрамикротоме со стеклянными ножами, небольшой блок, содержащий область интереса близко к поверхности, сделан. Блок помещается внутри FIB / SEM и ионных пучков используются для примерно мельница вертикальной плоскости вдоль одной стороны блока, близко к этому региону. Использование обратного рассеяния электронов на изображение глубинных структур, меньшей грани затем фрезеровать с ионным пучком тоньше и поверхности тщательно более тесно для определения точной области лица для включения в образ и фрезерованные. Параметры микроскопа затем установить так, чтобы лицо неоднократно измельчают, отображаемого так что последовательные изображения собираются в объеме блока. Изображение стек, как правило, содержат изотропной вокселей с размерами, небольшим 4 нм в каждом направлении. Это качество изображения в любой плоскости воспроизведения позволяет пользователю анализировать ультраструктуры клеток в любой угол обзора в пределах изображения стека.

протокол

1. Фиксация проб и смолы вложение

1. Образцы свежей ткани и клетки фиксируют, по крайней мере 2 часа в 2% параформальдегида, и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,4. Размер выборки не должна превышать 0,150 мм в толщину для обеспечения адекватного проникновения или фиксатора, и не должны быть оставлены на исправление более 12 часов.
2. Место образцов в 20 мл флаконы сцинтилляционные стекла и промойте их в три раза, 5 минут каждая, в буфере 0,1 какодилатном.
3. Пятно с 1,5% (м / о) ферроцианида калия и 1% (м / о) осмия в 0,1 М какодилатном буфере (0,1 М, рН 7,4) в течение 30 минут.
4. Пятно с 1,0% (м / о) осмия в буфер 0,1 М какодилатном течение 30 минут.
5. Полоскание один раз с двойным дистиллированной воде в течение 3 минут.
6. Пятно с 1% (м / о) уранилацетата в бидистиллированной воде в течение 30 минут.
7. Промыть разделы течение 5 минут в дистиллированной воде, а затем обезвоживают в градуированных серии спирта, 2 минут каждое изменение (1 х 50%, 1 х 70%, 1 х 90%, 1 х 95%, 2 х 100%).
8. Добавить в возрастающих концентрациях Durcupan смолы, смешанной с этанолом, 30 минут каждое изменение, начиная с 50% Durcupan в этаноле, затем следуют: 70%, 90%, 95%, а затем 100%.
9. Замените свежие Durcupan и агитировать медленно в течение 4 часов.
10. Место разделах, используя деревянные палочки коктейль, на стекле микроскопа слайды покрытые плесенью разделяющий агент, и места в 65 ° С духовке в течение 24 часов.

2. Подготовка проб для FIB / SEM

11. Отдельные смолы слой, содержащий образцы, с места между двумя предметными стеклами стекла микроскопа и тщательно промыть, чтобы удалить плесень разделительное средство.
12. Использование микроскопа проходящего света с низким целям власти, или рассечение микроскопом в проходящем освещении, для определения области интересов в рамках кусочек смолы.
13. Вырезать небольшой (3 мм х 3 мм) квадрат вокруг интересующей нас области использования лезвие и придерживаться этого в начало пустой блок смолы с акриловым клеем (рис. 1). Подождите 5 минут, когда клей затвердеет, а затем приступить к следующему шагу.
14. Зажим блока в держатель ulramicrotome и, используя прилагаемый стереомикроскопа, обрезка по всему региону, представляющие интерес с лезвием пока лишь небольшая пирамида материал остается.
15. Дальнейшая отделка блок, с использованием стекла нож фиксируется в ультрамикротоме, так что область интереса может быть точно расположены относительно размеров поверхности блока (рис. 1). Вырезать один край блока, близко к области интереса, так что перпендикулярно шаг прорезается образца (рис. 1 и 2). Этот шаг формы изображения лица (рис. 2).
16. Удалить блок из ультрамикротоме и сфотографировать области интересов в рамках блока, используя проходящем свете микроскопа.
17. Вырезать отделаны квартале от оставшейся смолы заглушки. Это делается с помощью видел ювелирного и гарантирует, что только небольшой блок размещается внутри FIB / SEM. Общая высота этого блока не должна быть более 5 мм.
18. Клей для блоков алюминия заглушки с углеродом пасты обеспечение того, чтобы стороны для включения в образ находится на внешней кромке (рис. 1).
19. После высыхания клея, флаг блока с тонким слоем золота (> 20 нм; Крессингтон вакуумного испарения системы).

3. Изображений в FIB / SEM

20. На малом увеличении, а с использованием вторичных электронов изображения (5 кВ, 0,5 nAmp), ориентироваться блок так, чтобы выбранной области интереса и стороны блока для включения в образ стоит перед оператором (рис. 2 в, г).
21. Восток блок так, чтобы лицо для включения в образ лежит параллельно фрезерные луча. Это означает, что пучок электронов ориентированы на 54 ° к этой грани (рис. 2 б).
22. Использование ионного тока пучка от 13 - 27 nAmps на 30 кВ удалить узкой полосы смолы с передней области для включения в образ.
23. Переключение в режим отраженных изображений, чтобы посмотреть в лицо фрезерованные, который перекрывает области интереса.
24. Использование светлый образ ссылкой микроскопии (приняты на шаг 16) и образ фрезерованные лицо найти точные области на блок для фрезерного и образ (рис. 2).
25. Депозит защитный слой (примерно 1 микрон) углерода (или металла), с помощью системы закачки газа в микроскоп, на поверхности блока, прежде интересующей области (рис. 2).
26. Использование тока 700 picoAmps, мелко мельница области блока, в котором окончательные изображения будут приняты.
27. Оставьте фрезерные луч полностью мельница изображения лицо, пока не фрезерные артефакты можно увидеть на лице. Полный мельницу лицо проверяется путем наблюдения изменения в каждый последующий изображения по всему полю зрения. Недостаточная фрезерные также может рассматриваться как белые полосы или «шторы» появляются Vertically в изображении.
28. Оставьте микроскоп для не менее 2 часов для любых тепловых изменений, чтобы рассеять. Это снижает риск того, что блок лицо будет дрейфовать во время съемки, в результате чего разрегулированные изображений.
29. Выберите микроскопом параметры для работы с изображениями лица серийно. Убедитесь, что электронный пучок имеет напряжение, которое является достаточно низким, чтобы только изображение очень небольшой глубине материала в блоке лицо. Это также должно быть гораздо мельче, чем толщина лица должны быть удалены. Типичные параметры для работы с изображениями в напряжении от 1,2 - 2,0 кВ с пиксельными размерами от 4 - 20 нм. Пиксель время выдержки должно быть сохранено около 10 μsecs так, чтобы общее время на мельницу лицо и приобрести одного изображения сохраняется менее 2 минут (рис. 3).

4. Секреты успеха

Шаг 1) Убедитесь, образцы толщиной не более 150 мкм. Это даст возможность адекватного проникновения различных пятен и смолы в материал. Это может быть достигнуто путем срезов образцов с vibratome сразу после фиксации. Такая толщина подходит для тканей мозга. Другие ткани должны быть проверены для обеспечения адекватной фиксации и окрашивания.

Шаг 3) образцы должны быть свободно распространены по всей решение, и не слипаются вместе, в одной части флакона в то время как этот вторичный фиксатор вводится. Это позволит обеспечить максимальное проникновение образца и уменьшить образец становится искаженной в этот процесс фиксации. Это достигается за счет мягко закрученного образцов в флакона сразу же после раствор добавляют.

Шаг 15) Убедитесь, что область интереса находится непосредственно под (<30 мкм) поверхности блока. Это позволит сократить количество фрезерных пучком ионов в фазе захвата изображений.

Шаг 22) время сканирования ионного пучка должна быть adequte для того, чтобы все лицо визуализации полностью фрезерованные. Недостаточная фрезерные будут показаны как белые полосы, или «шторы» появляются вертикально вниз изображения лица.

Шаг 26) окончательное фрезерованные лицо должно быть больше, чем лицо, что изображено. Это происходит потому, фрезерованные смолы выбрасывается из блока и redeposits на поверхности блока в непосредственной близости. Это переотложения может посягать на изображение поля зрения, и избежать, фрезерные гораздо большую площадь, чем образ. Для визуализации окно, которое составляет 20 мкм в ширину, фрезерованные кварталу превышает 30 микрон в ширину.

Шаг 29) Очень важно, чтобы параметры электронного пучка таковы, что изображение создается электронами, которые возникают из только первые несколько нанометров от поверхности блока. Это acheved путем минимизации напряжения до уровня ниже 2 кВ и обеспечения того, чтобы не электроны проникают слишком далеко. Это также помогло с помощью сетки напряжение на детекторе, так что только электрон с высоких энергиях вклад в окончательное изображение. Как правило, сетки напряжение 1,3 кВ используется для визуализации напряжением 1,5 кВ.

5. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Подготовка смолы блока.) Смола встроенных корональных раздел (80 микрон) с помощью взрослого мозга крысы рассматривать в steromicroscope. Изображение наглядно показывает различные участки мозга, которые могут быть вырезаны из раздела (б) с помощью лезвие скальпеля. Здесь, 1 мм, квадрат от коры снимается и (с) застряли в пустой блок смолы. Г) смолы блок затем отделан стеклом нож устанавливается в ультрамикротоме, и как только блок был сокращен до только оставить область интереса (е), шаг, вырезанные перпендикулярно передней поверхности встроенные материала. е) Весь этот регион обрезается затем разрезается от остальной части смолы и установлен на алюминиевой заглушкой готовы к металлическим покрытием и изображений в сканирующего электронного микроскопа.

Рисунок 2. Подготовка блока лицо FIB / SEM изображения.) И б) показать иллюстрации блока и край, который измельчают для создания изображения лица (указывается с черным двуглавым стрелкой). Положение ионного пучка (белый) показан параллельно изображение лица и электронного пучка (серый) показан удар лицом при 54 ° до ионного пучка. В) показан вид блока принимать с электронным пучком и полученную с использованием вторичных электронов. Вдоль этой стороне блока темные области (на рисунке показана пунктирной белой коробке) показывает, часть лица, которая была грубо молотый (показано с двойной головкойред черная стрелка), чтобы выявить основные образца. г) Когда эта область изображается только с помощью отраженных электронов встроенный ткани могут быть видны. Здесь, по всей ширине ткани встроенный раздел обозначается двуглавого белая стрелка. Шкала бар с) составляет 100 мкм.

Рисунок 3. Изображений объем мозговой ткани с изотропными вокселей.) Обратный контрастность отраженных образ кварталу показывающий ультраструктуру в области головного мозга крыс. Все мембраны видны, а также крупных макромолекулярных структур. Б) в общей сложности 1600 изображений были собраны в 5 нм расстояния в результате чего изображение стек с изотропными вокселей. В) Этот стек могут быть отображены в любой плоскости, с таким же разрешением. Это изображение показывает одну синаптической связи, что изображено в плоскости ху и плоскости YZ.

Обсуждение

Техника FIB / SEM работ оптимально, когда область интереса не слишком велика. Верхний предел для отображаемого объем зависит от ионного пучка и область, что он может последовательно мельница неоднократно в течение многих часов. До сих пор это было сделано с участками около 60 х 60 микрон, тем не менее, работы с изображениями весь этот район не представляется возможным с соответствующим разрешением, в основном за счет фактора времени в сборе таких больших изображений. В качестве примера, 4 кх 4 к изображение с пиксель время выдержки до 10 микросекунд займет 2 минуты и 40 секунд, чтобы приобретать, и для поля зрения 60 микрон это было бы дать только размером пиксела 15 нм. Для визуализации ультраструктуры клеток и тканей, меньше размер пикселя больше подходит, обычно от 4 до 10 нм / пиксель. Для площадью 60 х 60 мкм изображение будет приобретено в 10 часов, даже если микроскоп было такой возможности. По этим причинам, микроскоп идеальным инструментом для изображения объемов порядка 10 х 10 х 10 микрон, либо значимых регионах целые клетки. Это можно легко сделать в течение 48-часового периода на образцах, которые хорошо контрастируют с этой процедурой.

Пока протокол был использован главным образом с мозговой ткани, а также различных видов культивируемых клетках млекопитающих придерживаясь покровные. Тем не менее, фиксации и окрашивания процедура может быть использована со многими другими видами биологического материала, в том числе растительного сырья для производства одинаково хорошо контрастируют стеки изображения.

Поэтому основным преимуществом этого метода является его способность изображения объемы с изотропными вокселей. Изображение стеки данного типа позволяют для анализа 3-й тома с помощью изображений, полученных в любой плоскости в стеке. Преимуществом этого является предоставление наблюдателю деталей изображения в изображение серии с любого направления и обеспечения большей детализации изображения (рис. 3).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Цианакрилатный клей
Пройдя через микроскоп Leica MZ8	Leica Microsystems, Германия
Durcupan смолы	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария
FIB / SEM микроскоп (Zeiss, Энвижн 40)
Стекло гистологии слайдов	Menzel-Glaser, Германия	AA00008032E
Стекло ножом производителя: Leica EM KMR2	Leica Microsystems, Германия
Стекло сцинтилляционных флаконов (20 мл)	EMS, США	72634
Глутаральдегид	EMS, США	16222
Ювелирное видел	EMS, США	72010
Плесень разделительное средство	Glorex, Швейцария	62407445
Осмий четырехокиси	EMS, США	19110
Параформальдегид	EMS, США	RT 19208
Фосфаты соли для фосфатного буфера	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария	71642 и 71496
Натрий какодилатном	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария	20840
Sputter Coater золотом целевой	Крессингтон, США
Трис базы (TBS)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Швейцария	T1378
Ультрамикротоме: Leica UCT	Leica Microsystems, Германия
Уранилацетата	EMS, США	RT 22451