Количественная оценка иммунных клеток в поврежденный спинной ткани шнура с помощью проточной цитометрии: Роман Используйте для метода очистки сотовый

Резюме

Количественная оценка сотовой воспаление в поврежденной / патологических ЦНС с помощью проточной цитометрии осложняется липидов / миелина мусора, который может быть одинакового размера и грануляции в клетки, уменьшая чувствительность / точность. Мы продвинулись метод ячейки подготовки, чтобы удалить миелина мусора и улучшить сотовые обнаружения методом проточной цитометрии в поврежденный спинной мозг.

Аннотация

Обнаружение иммунных клеток в поврежденной центральной нервной системы (ЦНС) с использованием морфологических или гистологических методов не всегда при условии, истинный количественный анализ клеточного воспаления. Проточная цитометрия является быстрый альтернативный метод количественного иммунных клеток в поврежденной головного или спинного ткани мозга. Исторически сложилось так, проточной цитометрии был использован для количественного иммунные клетки собраны из крови или диссоциированных селезенки и вилочковой железы, и только несколько исследований попытались количественно иммунных клеток в поврежденный спинной мозг с помощью проточной цитометрии с использованием свежих диссоциированных тканей мозга. Тем не менее, диссоциированных тканей спинного шнур сосредоточено миелина с мусором, которые могут быть ошибочно приняты за клетки и уменьшить ячейку надежность подсчет получен поток цитометр. Мы продвинулись метод ячейки подготовки с использованием системы OptiPrep градиент эффективно отдельных липидов / миелина мусора из клеток, обеспечивая чувствительных и надежных количественных клеточного воспаления в поврежденный спинной мозг с помощью проточной цитометрии. Как описано в нашем недавнем исследовании (Beck & Нгуен и др., 2010 фев мозга; 133 (Pt 2):.. 433-47), подготовка OptiPrep клетка была повышенной чувствительностью для обнаружения сотовых воспаления в поврежденный спинной мозг, с пунктам специфические типы клеток коррелирует с тяжестью травмы. Чрезвычайно важно, роман использование этого метода при условии, первый характеристика острого и хронического воспаления сотовой после ТСМ включить полный курс время для полиморфноядерных лейкоцитов (PMNs, нейтрофилы), макрофаги / микроглия и Т-клеток в течение периода, составляющего от 2 часов до 180 дней после травмы (точек на дюйм), выявление удивительного романа второй фазе клеточного воспаления. Тщательное характеристика клеточных воспаления с помощью этого метода может обеспечить лучшее понимание neuroinflammation в поврежденной нервной системы, и выявить важные мультифазные компонент neuroinflammation, которые могут иметь решающее значение для разработки и внедрения рациональных терапевтических стратегий лечения, в том числе и клеточных и фармакологических мероприятий по ТСМ.

протокол

1. Диссоциация спинного ткани шнура

1. Сегментов спинного мозга, T8-T10 не-травму или ушиб спинного мозга ранения (травмы T9) Sprague Dawley крыс были вскрыты и механически диссоциированных с мелкими ножниц в HBSS при комнатной температуре, как описано выше ^1. До ткани диссоциации, целые колонны спинного шнур держали на сухом льду в течение 5 минут до извлечения шнур сегментов Т8-Т10.
2. Ткань биты были получены путем центрифугирования (1 минута, 1000 оборотов в минуту, при комнатной температуре) и ферментативно диссоциированных с 2,5 мг трипсина и 5 мг коллагеназы в 5 мл DME (Media Дульбеко изменения Орла) в течение 20 минут при 37 ° С перед растиранием (~ 10 раз при комнатной температуре) со стеклянной пипетки Пастера (9-дюймов).
3. 10 мл DME + 10% эмбриональной телячьей сыворотки был добавлен в клетки для подавления активности ферментов, а затем фильтруют через 40 мкм ячейки фильтра. После быстрого спин, клеточный осадок ресуспендировали в 6 мл HBSS и наложенных на OptiPrep решения градиент описано ниже.

2. Создание OptiPrep градиента решения

1. Разводненная OptiPrep была построена путем разбавления OptiPrep 1:1 с MOPS буфера (0,15 М NaCl, 10 мМ MOPS, рН 7,4).
2. Четыре OptiPrep градиента решения выступили 350 смешивания, 250, 200, или 150 мкл разведенного OptiPrep с HBSS до конечного объема 1 мл (табл. 1).
3. Четыре решения медленно и осторожно положил в слоях в 15 мл коническую трубку с разбавленным мере в нижней части и наиболее разбавленного на вершине (рис. 1А).

3. Разделение липидов / миелина мусора из клеток

1. 6 мл диссоциированных клеток в спинном HBSS тщательно слой поверх решения OptiPrep градиента.
2. Труба, содержащих клетки и градиента решения центрифугировали (15 минут, 1900 оборотов в минуту или 726 RCF, 20 ° C) с помощью центрифуг Eppendorf 5810R с поворотно-ведро ротора (А-4-62), разделяющей ячейки решение на отдельные слои с нарушениями липидного / миелина мусора (верхняя 7 мл трубки), а затем 3-х слоев нейронов, при воспалительных клеток, глия, и эритроциты в осадке. Хотя большинство воспалительных клеток, включая моноциты, макрофаги, гранулоциты ПМН и лимфоциты были обнаружены в гранулах, некоторые крупные размеры активированные макрофаги могут быть найдены в слоях выше гранул.
3. Липидов / миелина мусора слой (вверху 7 мл) тщательно атмосферный и удалены. Затем клетки отмывали и ресуспендировали в 2,5 мл HBSS и используется для immunolabeling ниже.

4. Immunolabeling специфических иммунных клеток для проточной цитометрии

1. Клетки (500 мкл), собранных из спинного подготовки шнур осаждали и ресуспендировали в 0,85% хлорида аммония (разводят в дистиллированной воде) в течение 5 минут, чтобы лизировать эритроциты.
2. Клетки промывали 500 мкл HBSS и затем блокируется на 30 минут в нормальном кролика или мыши сыворотки при комнатной температуре.
3. Клетки промывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа с антителами (Кролик анти-PMN FITC, Точная химическая и научных; мыши против крыс ED1 Alexa 488, Serotec, или мышь анти-CD3 крысы Alexa 488) или изотипа IgG раствор разводят в HBSS (все в 1:100 разведение), как описано выше ^1.
4. Клетки промывали два раза после каждого шага выше, а затем ресуспендировали в 300 мкл HBSS после заключительного этапа.

5. Сотовые количественной оценки методом проточной цитометрии

1. Пробы были проанализированы на FACS Calibur (Becton Dickinson-) потока цитометр с помощью программного обеспечения сотового Quest. 5000 событий в образце читались для всех образцов и анализа данных была завершена с саммита (DakoCytomation).
2. Проточной цитометрии ворота были установлены с помощью контроля IgG изотипа меченых клеток или клеток спинного мозга из неповрежденных контрольных животных для установки базовых значений для нормализации во времени точки, как описано выше ^1. Средние значения положительно меченых клеток были выражены в процентах (± SEM) от всей выборки.

6. Представитель Результаты:

Способность градиента OptiPrep удалить миелина мусора и улучшить иммунную обнаружения ячейки с помощью проточной цитометрии оценивали по количественной спинного PMNs на 1 дюйм (рис. 1Б), ранее сообщалось пик проникновения ПМН после ТСМ ^1-3. Кроме того, одинаково расчлененный спинного мозга были ферментативно диссоциированных без OptiPrep-удаление миелина мусора и были также оценены параллельно ПМН проникновения проточной цитометрии. Как мы уже сообщали ранее ^1, произошел сдвиг в позиции событий в образцах с изолированной OptiPrep градиент способа очистки по сравнению с ферментативной диссоциации один, демонстрируя процент PMNs обнаружены в образцах с нетронутыми мусор миелина была лишь часть (0,5%) процентной доли PMNs обнаружено (5,1%) в OptiPrep purifСВУ образцов (рис. 1В). Эти данные позволяют предположить, что миелина мусора в тканевые препараты могут скрыть проточной цитометрии показаний, а также продемонстрировать, что удаление мусора миелина повышает чувствительность иммунной обнаружения ячейки в поврежденный спинной ткани мозга.

Установив чувствительность системы OptiPrep градиент для сотовых обнаружения в поврежденный спинной мозг, мы характерны изменения в клеточной инфильтрации в течение от 2 часов до 180 точек на дюйм и установил новый мультифазные ответ клеточного воспаления после ТСМ, которая включала PMNs, макрофаги / микроглии и Т-клеток. Как подтвердили предыдущие исследования ^1-3, PMNs впервые вошел мозга на 2 часа после травмы, а его пик на 1 дюйм (рис. 2 и 4). Макрофаги / микроглии, с другой стороны ^1,4,5, не были обнаружены в поврежденный спинной мозг до 3 точек на дюйм, а его пик первоначально на 7 точек на дюйм (рис. 3 и 4). Удивительно, но мы покажем, в первый раз, что макрофаги / микроглия пика во второй раз 60 точек на дюйм и оставались повышенными на 180 точек на дюйм (рис. 3 и 4). Как и в макрофагах / микроглии, Т-клеточной инфильтрации было предсказано до пика 7 точек на дюйм ^5-7, однако, проточная цитометрия не обнаружили никаких изменений в Т-клеточной номер в первые 7 точек на дюйм, хотя повышение количества Т-клеток был обнаружен на 9 точек на дюйм (1,6%) (рис. 4). Хотя Т-клеточные число было меньше на 10 точек на дюйм, стойкие Т-клеточная реакция наблюдалась на 180 точек на дюйм, в это время 4,4% от клетки были помечены для CD3 (рис. 4).

Вместе взятые, эти данные показывают, зависящего от времени мультифазные ответ клеточного воспаления после ТСМ (рис. 4); начальных фазах клеточного воспаления состояли из ранних пик PMNs 1 точек на дюйм затем пик ED1 + макрофаги / микроглия 7 точек на дюйм и Т -клеток 9 точек на дюйм, в то время как более поздних этапах были составлены из всех трех клеточных популяций рост после 14 точек на дюйм и сохраняющиеся на 180 точек на дюйм, с заметным второй пик макрофаги / микроглия в 60 точек на дюйм. Это исследование timecourse и количественных данных, полученных с помощью проточной цитометрии были утверждены ранее, показав сопоставимые результаты с данными, собранными от количественных стереологии из immunolabeled спинного разделов шнура ^1.

Таблица 1. Подготовка OptiPrep градиент для удаления мусора миелина. Четыре решения OptiPrep градиента с использованием HBSS и разводненная OptiPrep (1:1 разбавление OptiPrep и MOPS).

Рисунок 1. Плотности OptiPrep градиент отдельных наиболее миелина / мусора с поврежденный спинной мозг тканей / клеток и улучшения иммунной оценки ячейки с помощью проточной цитометрии. (А) Миелин / мусора была отделена от клетки (нейроны, глия и иммунных клеток) после центрифугирования диссоциированных тканей спинного шнур через градиент OptiPrep следуют стремление миелина / мусора слоем. (B) PMN номер в поврежденный спинной мозг, показывая, повышенная чувствительность в выявлении PMNs после уборки мусора (Стьюдента-тест, р = 0,0001). Все проточной цитометрии ворота были установлены с помощью меченых клеток из неповрежденных животных; п = 5 в каждой группе, в среднем ± SEM. 5000 событий в образце читались для всех образцов и средние значения положительно меченых клеток были выражены в процентах (± SEM) от всей выборки.

Рисунок 2. Обнаружение ПМН инфильтрации в поврежденный спинной мозг с помощью проточной цитометрии. После умеренной (200 кд) ушиб травмы T9, PMNs быстро вошел спинного мозга, начиная 2 часа (B) после травм и пиком 1 точек на дюйм (С). Все проточной цитометрии ворота были установлены с помощью меченых клеток из неповрежденных животных (А).

Рисунок 3. Обнаружение макрофаги / микроглия инфильтрации в поврежденный спинной мозг с помощью проточной цитометрии. После умеренной (200 кд) ушиб травмы T9, ED1 + макрофагов / микроглии число увеличилось в поврежденный спинной мозг, начиная с 3 точек на дюйм (D), остроконечные остро в 7 точек на дюйм (E), снизилась до низкого уровня в 14 точек на дюйм (F) , прежде чем подняться на второй пик в 60 точек на дюйм (G), и остался в поврежденный спинной мозг до 180 точек на дюйм (H). IgG изотипа контроль маркировки 7 точек на дюйм спинного клетки (B), показали минимальный антител маркировки фоновом режиме и никак не влияло на антитела, меченые клетки от 2 часов после травмы (С) или неповрежденной () животных. Все проточной цитометрии ворота были установлены с помощью меченых клеток из неповрежденных животных.

Таблица 2. Животное образцов в timecourse экспериментов. Для каждого момента времени (0 ч до 180 точек на дюйм), пять животные получали умеренные (200 кд) ушиб травмы T9,и спинного ткани шнур оценивали с помощью проточной цитометрии для чисел PMNs, ED1 ⁺ макрофаги / микроглия и CD3 ⁺ T-клеток. Однако, не все образцы животных были успешно восстановлены для ПМН (4-5), ED1 (3-5) и CD3 (4-5) проточной цитометрии анализа.

Рисунок 4. Timecourse клеточного воспаления в спинном мозге после умеренной (200 кд) ушиб травмы Т9. Как оценивается проточной цитометрии, номера PMNs, ED1 ⁺ макрофаги / микроглия и CD3 ⁺ T-клеток пика остро (1,7 и 9 точек на дюйм, соответственно) и сохранялись хронически в поврежденный спинной мозг. П = 3 до 5 процентов Группа, в среднем ± SEM.

Обсуждение

Использование проточной цитометрии для количественного иммунных клеток в ЦНС осложняется липидов / миелина содержание и мусора. В дополнение к обязательным вмешательства антитела и специфичность, миелина мусора может быть одинакового размера и грануляции свойства клетки иммунной системы, снижая чувствительность и точность измерений ^8. Подготовка романа ячейки метод, описанный здесь, является эффективным в удалении миелина мусора и тем самым улучшает чувствительность проточной цитометрии для обнаружения изменений в клеточных воспаления в поврежденный спинной мозг. Например, удаление мусора миелина этим методом, усовершенствованные функции обнаружения иммунных клеток по сравнению с ферментативной диссоциации alone.Critically, роман использования этого метода позволило первым характеристика острого и хронического воспаления сотовой после ТСМ включить полный курс время для PMNs, макрофагов / микроглии, и Т-клеток до 180 точек на дюйм, и определил роман второй фазы клеточного воспаления. Эти важные результаты мультифазные компонент neuroinflammation может иметь решающее значение для разработки и внедрения рациональных терапевтических стратегий лечения, в том числе и клеточных и фармакологических вмешательств по ТСМ.

Система OptiPrep градиент был использован для разделения мусора из клеток в крови ⁹ или очистить от нейронов мозга к клеточной культуре ¹⁰ целей, однако, мы изменили и передовые системы этот метод для разделения миелина мусора из спинного мозга диссоциированных клеток, и позволило быстрыми и более точную количественную оценку сотовой воспаления с помощью проточной цитометрии. Этот метод вместе с проточной цитометрии, вероятно, обеспечит значительное продвижение в воспаление исследования после ЦНС травм или патологических состояний, так как большинство исследований только характеризуется сотовой воспаления в ЦНС с использованием морфологических и гистологических методов, которые не являются камерного типа специфических или не всегда могут предоставить правдивую количественные оценки. Кроме того, несколько последних исследований попытались количественно иммунных клеток в поврежденный спинной мозг с помощью проточной цитометрии с использованием свежих диссоциированных ткани шнур ^11,12 или ячейки, разделенные градиент Перколла системы ^13, однако эти исследования продемонстрировали, либо низкие урожаи ячейки или регистра обнаружение иммунных клеток.

С другой стороны, клетка OptiPrep градиент метод подготовки предусмотрела впервые, чувствительная и надежная количественная оценка с помощью проточной цитометрии к изменению клеточного воспаления в ответ на градуированной тяжести травмы и в течение длительного timecourse до 180 точек на дюйм. Чувствительности и надежности проточной цитометрии также зависеть от специфики антител, применяемых для обнаружения определенных типов иммунных клеток, как проточная цитометрия не позволяет морфологические критерии дальнейшего различать типы клеток. Специфичность антител для PMNs, макрофаги / микроглия или Т-рассказывает был тщательно протестирован в проточной цитометрии для перитонеального PMNs и альвеолярных макрофагов в области культуры и клеток в поврежденный спинной ^1,2 ткани мозга. Вместе с системой градиент OptiPrep, эти антитела для проточной цитометрии внесли свой вклад в поколение временной и количественный анализ клеточного воспаления, что обеспечило новому взглянуть на динамику микроокружения SCI, и определили в первый раз расширенной мультифазные ответ клеточного воспаления. Это мультифазные ответ клеток после ТСМ может быть важно исследовать роль специфических типов клеток, присутствующих на определенное время после травмы или генерировать терапевтических вмешательств против определенных типов клеток, которые могут вызвать обострение перенесенных травм. Кроме того, эти данные могут помочь в разработке соответствующего обоснования оптимального вмешательства наркотиков или клеточной для ТСМ.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
OptiPrep	Fisher Scientific	NC9182490
HBSS	Сигма	H1387
Кролик против крыс ПМН (FITC)	Точная химическая и научно	AIFAD51140
Мышь против крыс ED1 (Alexa Fluor 488)	Абд Serotec	MCA341A488
Мышь анти-CD3 крысы (FITC)	Абд Serotec	MCA772F
Трипсин	Сигма	T9935
Коллагеназа	Сигма	C5138
DME	Сигма	D1152
МЫШИ IgG1 (Alexa Fluor 488)	Абд Serotec	MCA1209A488
Фетальной телячьей сыворотки	Hyclone	SH30070.03
Кролик сыворотке	Джексон ImmunoResearch	011-000-120011-000-120
Мышь сыворотке	Джексон ImmunoResearch	015-000-120
Сотовый фильтр	BD Сокол	352340