Градиент генерирующих микрожидкостных Устройство для клеточной биологии

Резюме

Мы опишем протокол для микротехнологий градиента генерирующих микрожидкостных устройств, которые могут генерировать пространственные и временные градиенты в четко определенных микроокружения. При таком подходе, градиент генерирующих микрожидкостных устройство может быть использовано для изучения направлены миграции клеток, эмбриогенез, заживление ран и рака метастазы.

Аннотация

Изготовления и эксплуатации градиент генерирующих микрожидкостных устройств для изучения сотовой поведение описано. Микрожидкостных платформа позволяет экспериментальный инструмент, потому что она может точно управлять потоками жидкости, обеспечивают высокую пропускную экспериментов, а также генерировать стабильный растворимый градиенты концентрации. По сравнению с обычными генераторами градиент, поли (диметилсилоксана) (PDMS)-основанной микрожидкостных устройств может генерировать стабильный градиент концентрации факторов роста, с четко определенными профилями. Здесь, мы разработали простой градиент генерирующих микрожидкостных устройств с тремя раздельными входами. Три микроканалов объединены в один микроканальных для создания градиентов концентрации. Стабильность и форму градиенты фактор роста были подтверждены флуоресцеина isothyiocyanate (FITC)-декстрана с молекулярной массой похож на эпидермальный фактор роста (EGF). Используя этот микрожидкостных устройств, мы показали, что фибробласты подвергается градиентов концентрации ЭФР мигрировал в сторону более высоких концентраций. Направленной ориентации миграции клеток и моторику мигрирующих клеток были количественно оценены ячейки отслеживания анализа. Таким образом, этот градиент генерирующих микрожидкостных устройство может оказаться полезным для изучения и анализа поведения мигрирующих клеток.

протокол

А. микротехнологий градиента генерирующих микрожидкостных устройств

1. Пластины кремния обрабатывают реактивные кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
2. Отрицательные фоторезиста (ГУ-8 50, Microchem, MA) является спин-покрытием при 1000 оборотов в минуту в течение 1 мин на пластины кремния.
3. Пластины мягкой выпекают при температуре 65 ° С в течение 10 мин, а затем при 95 ° С в течение 30 мин на плите.
4. Пластины под действием УФ света (200 Вт) в течение 3 мин через маску прозрачности с минимальным размером особенностью 30 мкм.
5. Пластины сообщение выпекают при температуре 65 ° С в течение 1 мин, а при 95 ° С в течение 10 мин.
6. Si мастер формы с толщиной 100 мкм каналов разработан с использованием SU-8 фоторезиста разработчика.
7. Пластины содержащей микроканалов помещается в Петри-блюдо.
8. Поли (диметилсилоксана) (PDMS) (Sylgard 184) формы изготавливаются путем смешивания эластомера силикона и отвердителя (10:1).
9. Смесь PDMS выливают на плесень мастер Si.
10. Плесень Si мастер находится на вакуумном эксикаторе, чтобы удалить пузырьки в течение 10 мин.
11. PDMS отверждается при температуре 70 ° С в течение 1 ~ 2 часа.
12. PDMS Формы снимают с формы мастер Si.

Б. Экспериментальная установка

1. Сотовые вход, выход, и вливая губах PDMS основе микрожидкостных устройств пробиваются с помощью резкого перфораторы.
2. Устройство и стекло (2 × 3 дюйма) необратимо связанных с реактивной кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
3. Полиэтиленовые трубы (ПЭ 20, Becton Dickinon, MD) вставляется в вливая губах микрожидкостных устройств, а затем подключен к шприцевой насос.
4. Fluorescein изотиоцианат (FITC)-декстран (MW = 10kD, 10 мкм, Sigma) и буфером (PBS, Invitrogen, Калифорния) переплетаются в микрожидкостных устройств подтверждением стабильного градиентов внутри жидкостных устройств.
5. Внеклеточного матрикса (ECM) (например, фибронектин) покрыты внутри микрожидкостных устройств в течение 1 часа в инкубатор (37 ° С).
6. NIH 3T3 фибробласты являются трипсином и диссоциирован.
7. Расхождение между клетками загружаются в микрожидкостных устройств (800 мкм в ширину) при плотности клеток 2 × 10 ⁶ клеток / мл.
8. 2 мл СМИ и 50 нг / мл эпидермального фактора роста (ЭФР) придают в микрожидкостных устройств для генерации растворимые градиентов используйте шприцевой насос (0,05 мкл / мин).
9. Клетки в режиме реального времени мониторинг каждые 5 минут с помощью инвертированного микроскопа (Nikon TE 2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Клетки подвергаются стабильный градиент концентрации ЭФР в микрожидкостных устройств мигрировал в сторону более высоких концентраций. Направленной ориентации клеточной миграции, хемотаксиса индекс, моторику мигрирующих клеток были исследованы по мобильному отслеживания анализа. Таким образ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran-FITC	Reagent	Sigma-Aldrich	FD10S	Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD)
hr-EGF		Invitrogen	13247-051	human recombinant Epidermal growth factor
PDMS		K.R. Anderson Co.	2065622	Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
Negative photoresist		MicroChem Corp.	SU-8 50
Si wafer				silicone wafer, 4 inch
Petri dishes
Polyethylene tubing		BD Biosciences	PE 20
PBS		Invitrogen
Fibronectin
NIH 3T3	cell-line			fibroblast cells
Inverted microscope		Nikon Instruments	TE 2000