Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Резюме

Оптическое разрешение ФА микроскопии (ИЛИ-PAM) является новая технология способна изображений оптического поглощения контрастов В естественных условиях С сотовыми разрешение и чувствительность. Здесь мы предоставляем визуализированы инструкции по экспериментальным протоколам ИЛИ-PAM, включая конфигурацию системы, системы выравнивания, типичные В естественных условиях Экспериментальных процедур и функциональных схем визуализации.

Аннотация

Оптическая микроскопия, предоставляя ценную информацию на клеточном уровне и органелл, получил широкое признание как позволяет биомедицинских технологий. Как опорой в естественных трехмерных (3-D) оптической микроскопии, single-/multi-photon флуоресцентной микроскопии и оптической когерентной томографии (ОКТ) продемонстрировали свою чрезвычайной чувствительностью к флуоресценции и рассеяния оптического контраста, соответственно. Тем не менее, оптический контраст поглощение биологическими тканями, который кодирует существенные физиологические / патологической информации, до сих пор не для оценки.

Появление биомедицинских фотоакустика привело к новой отрасли оптической микроскопии оптическим разрешением ФА микроскопии (ИЛИ-PAM) ^1, где оптические облучения ориентирована на дифракционный предел для достижения сотовых ¹ или даже ² субклеточном уровне латерального разрешения. Как ценным дополнением к существующей оптической технологии микроскопии, ИЛИ-PAM вызывает, по крайней мере две новинки. Первое и самое главное, ИЛИ-PAM обнаруживает оптические контрасты поглощения с необычайной чувствительности (т.е. 100%). Объединение или-PAM с флуоресцентной микроскопии ³ или с оптико-рассеяния основан ^{4 октября} (или с обоими) обеспечивает всестороннюю оптических свойств биологических тканей. Во-вторых, ИЛИ-PAM кодирует оптического поглощения в звуковые волны, в отличие от чистой оптических процессов в флуоресцентной микроскопии и октябре, а также предоставляет фоновом без обнаружения. Акустического обнаружения в ИЛИ-PAM смягчает воздействие оптического рассеяния от деградации сигнала и, естественно, исключает возможные помехи (например, перекрестных помех) между возбуждения и регистрации, что является распространенной проблемой в флуоресцентной микроскопии из-за перекрытия между возбуждения и флуоресценции.

Уникальный для оптических изображений поглощения, ИЛИ-PAM продемонстрировала широкой биомедицинских приложений с момента своего изобретения, в том числе, но не ограничиваясь, ^{5 неврологии, 6,} офтальмологии, ^{7, 8,} сосудистой биологии ^{9, 10} и дерматологии. В этом видео, мы учим, конфигурации системы и выравнивание ИЛИ-PAM, а также экспериментальные процедуры в естественных условиях функциональной визуализации микрососудов.

протокол

1. Конфигурация системы

1. Оптический облучения
   1. Оптический источник облучения: с диодной накачкой твердотельным импульсным лазером (INNOSLAB, Edgewave) и лазер на красителях (CBR-D, Сира).
   2. Выходной пучок лазера (длительность импульса: 7 нс), фокусируется линзой конденсатора (LA1131, Thorlabs), чтобы пройти через 50-мкм обскуры (P50C, Thorlabs).
   3. Отверстие находится немного в стороне от фокуса линзы конденсатора, чтобы соответствовать отверстие диаметром с основной моды диаметр пучка для эффективной пространственной фильтрации.
   4. Фильтруется луч ослабляется нейтральной плотности фильтра (NDC-50C-2М, Thorlabs), а затем вводится в одномодового оптического волокна (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
   5. Выход волокна заполняет заднюю апертуру объектива микроскопа (RMS4X, Thorlabs) для достижения дифракционного оптического фокуса ~ 2,6 мкм при длине волны 570 нм.
2. Ультразвуковая
   1. Ультразвуковой датчик: 50-МГц центральная частота (V214-BB-РМ, Olympus-NDT).
   2. Ультразвуковой датчик прикреплен к самодельной акустической оптический луч комбайнером ¹¹ для ультразвукового обнаружения, которые выравнивается соосно с дифракционной оптического облучения.
   3. Сферической полости земли из нижней части комбайнера для производства акустических линз. Это акустическая линза имеет числовой апертурой 0,5 в воде и дает акустический координационного диаметром 43 мкм на 50-МГц центральным.
   4. Оптические и акустические фокусы выравниваются confocally максимально чувствительность обнаружения.
3. Акустическая связь
   1. Сухой ультразвуковой связи используется, чтобы избежать погружения экспериментальных животных в воде, которая была использована в начале фотоакустической систем визуализации ^12.
   2. Визуализации окно открывается в нижней части чашки Петри (9 см в диаметре) и уплотняется ультразвуковым и оптически прозрачной оболочкой из полиэтилена.
   3. Ультразвуковой гель (Clear Image, SonoTech) между мембраной полиэтилена и объектов для включения в образ пары сгенерированных фотоакустической волны от объекта в чашке Петри, и деионизированной воды в чашке Петри дальнейшего пары волны погружения ИЛИ-PAM голову изображений .
4. Электроника
   1. ФА сигнал обнаружен ультразвукового преобразователя усиливается два каскадных усилителей (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
   2. Усиленный сигнал оцифровывается 14-битным сбора данных (DAQ) пансион (CompuScope 14200, Gage Applied Sciences) при частоте дискретизации 200 MS / s.
5. Схема сканирования
   1. Двумерные (2-D) растровых сканирование ИЛИ-PAM изображения головы вдоль горизонтальной плоскости (ху) управляется персональным компьютером, который вызывает как плата DAQ и лазера накачки. Запускающий сигнал синхронизируется с часами-аута от платы ввода-вывода.
   2. Быстро оси 2-D сканеров определяется как направление поперечного сечения сканирования (В-сканирование).
   3. Последовательность В-сканирование изображений может быть приобретено путем перевода изображений головой вдоль медленной оси, чтобы сформировать объемные изображения, которые могут быть просмотрены либо в прямой 3-D рендеринга или в 2-D Максимальная амплитуда проекции (MAP) изображение .

2. Система выравнивания

1. Использование эхо-ультразвука и ультразвуковой отражателя, чтобы определить положение акустических фокальной плоскости (т. е. время задержки от сигнала запуска до максимального эхо-ультразвукового сигнала). Этот шаг необходимо проделать только один раз при создании ИЛИ-PAM системы.
2. Максимальная эффективность связи одномодового волокна.
3. Применение ультразвуковой гель на вершине оптически поглощающих объекта (например, кусок черной лентой) и аккуратно прикрепить его под изображения окна в чашке Петри заполнена деионизированной водой.
4. Нижняя изображений головой в воду, и удалить пузырьки воздуха в ловушку под акустические линзы.
5. Настройка изображения головы, пока фотоакустического сигнала поглощающего объекта от акустических фокальной плоскости, о чем можно судить из акустической задержки.
6. Отрегулируйте вертикальное положение (например, г позицию) объектива микроскопа максимально амплитуды ФА-сигнала, генерируемого с плоским предметом. Максимальной амплитуды сигнала о том, что оптический фокус в соответствие с акустическими фокус в вертикальном направлении.
7. Отрегулируйте горизонтальном положении (то есть, х и у позиции) объектива микроскопа до фотоакустической сигнал, генерируемый из целевого показывает симметричной картины. Симметрии позволяет предположить, что оптический фокус в соответствие с акустическими фокус в горизонтальном направлении.
8. Повторите шаги 2,6 и 2,7 до фотоакустического сигнала оптимизирована как симметрия и амплитудой.

3. Са mple экспериментальной процедуры, в естественных условиях ИЛИ-PAM из уха мыши сосудистую

1. Этот шаг не является обязательным для голых мышей. Обезболить животное с внутрибрюшинного введения коктейль [рецепт: 1 мл кетамина (100 мг / мл), 0,1 мл ксилазина (100 мг / мл), и 8,9 мл физиологического раствора; доза: 0,1 мл на 10 г]. Бритье волос в ухе, а в дальнейшем удалять волосы остаточные волосы Surgi крем (Категория #: 82565, American International Industries) перед чисткой деионизированной водой. Обратите внимание, что такая эпиляция может слегка раздражать кожу сосудистую и, таким образом лучше всего проводить за 24 часа до планируемого эксперимента.
2. Включите фотоакустической лазерной системы, а также проверить системы выравнивания.
3. Обезболить мышь с 3% ИФ испаряется при вдыхании газа (типичный расход 1,0-1,5 л / мин, в зависимости от массы тела животного), и поддерживать анестезии с 1% изофлуран течение всего эксперимента. Медико-класса воздух рекомендуется как вдыхание газа для поддержания мыши на нормальные физиологические состояния.
4. Передача мыши стереотаксической этапе, и контролировать ее температуру тела при температуре 37 ° С грелку.
5. Свести уха мыши на пластиковую пластину и нанесите слой ультразвука гель в верхней части уха. Избежать захвата пузырьков воздуха внутри геля. Затем, место под ухом визуализации окна и медленно поднимите животной стадии до ультразвуковой гель контакты нижней части полиэтиленовой оболочкой. Мягкие контакта необходимо, так как нажатие ухо к мембрана может повлиять на приток крови в ухе.
6. Зажим пульсоксиметр для ног или хвоста мыши, чтобы следить за его физиологического состояния, а также применять мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость и случайного повреждения лазерных мышей глаза.
7. Нижняя изображения головы, пока акустические линзы погружают в деионизованной воде и удалить пузырьки воздуха в ловушку под акустические линзы.
8. Проверьте лазерной энергии, чтобы убедиться, что она находится в пределах лазерной безопасности стандартам Американского национального института стандартов ^13. Лазерной энергии не должна превышать 20 мДж / см ^2, что означает 80 нДж от энергии лазерного импульса, когда лазерный луч фокусируется на 150 мкм под поверхностью кожи.
9. Установить лазер внешнего триггера режима и начать судебный процесс сканирования. Отрегулируйте положение г изображения головы, пока сильные фотоакустической сигнал от акустического фокальной плоскости.
10. Установите правильные параметры сканирования и начать формальное захвата изображений.
11. После эксперимента, выключите лазер, поднимите изображений голову из деионизированной воды, ниже животной стадии, чтобы освободить мышь, чистый уха мыши деионизированной воды, выключить систему анестезии и регулятор температуры, и выгружать мыши от стереотаксической стадии.
12. Если повторяющихся изображений не требуется, положить мышь в инкубатор с температуры окружающей среды установлен на уровне 37 ° C. Вернуться мыши животных объекта после его просыпается естественным путем. В противном случае следуйте животных протоколов euthanatize и распоряжаться им.

4. Функциональные ИЛИ-PAM общего содержания и насыщения кислородом гемоглобина

1. Оксигемоглобина (HBO ₂₎ и дезоксигемоглобин (HBR) являются двумя основными формами гемоглобина, преобладающим эндогенных фотоакустической источник в видимой области спектра. HBO ₂ и HBR имеют различные оптические спектры поглощения и, следовательно, могут быть дифференцированы спектрально количественно как общая концентрация (HBT) и насыщения крови кислородом (SO ₂₎ гемоглобина ^5. Вот две рекомендации, которые помогут выбрать правильный оптических длин волн для SO ₂ измерения:
2. Длины волн должны быть выбраны в Q-диапазоне спектра поглощения гемоглобина (например, 550-600 нм), чтобы обеспечить достаточный сигнал-шум и адекватного проникновения.
3. Длины волн, где коэффициенты поглощения HBO ₂ и HBR есть сильное различие (например, HBR-доминирующей 561 нм и HBO _{2-доминирующей} 578 нм) рекомендуется.

Кроме того SO _2, HBT может быть рассчитана, добавляя [HBR] и [HBO _2] вместе, или он может быть измерен при длине волны изобестической молярной спектры коэффициента ослабления гемоглобина (например, 530 нм, 545 нм, 570 нм, а 584 нм) ^14, где HBR и HBO ₂ имеют равные молярные коэффициенты погашения.

5. Представитель Результаты:

Показанный на рисунке 1 сосудистой анатомии и SO ₂ в живой обнаженной уха мыши изображено двойной длины волны (561 и 570 нм) или-PAM. Типичное время захвата изображений для двухволновой SO ₂ измерения такой области, представляющие интерес (размер: 10 мм х 10 мм с шагом: 2,5 мкм и длиной 5 мкм) составляет ~ 80 мин.

p_upload/2729/2729fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. В естественных условиях оптического разрешения ФА микроскопии. КАРТА изображения (А) общей концентрации гемоглобина показывает сосудистой анатомии (приобретенные при 570 нм) и (б) насыщение гемоглобина кислородом (приобретенных на 561 нм и 570 нм) в обнаженном уха мыши. (C) Крупный план коробку региона в панели (). Шкалы на графике () относится как к (А) и (Б).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом видео, мы предоставляем подробную инструкцию по экспериментальным протоколам ИЛИ-PAM, включая конфигурацию системы, системы выравнивания и типичных экспериментальных процедур. Этикетка-свободной, неинвазивный ИЛИ-PAM позволила исследования микрососудистых функционирования и о?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы