В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

Резюме

Малоинвазивных протокол для стабилизации позвоночника мыши и выполнять повторяющиеся В естественных условиях Спинного изображений шнур с помощью двух-фотонной микроскопии описаны. Этот метод сочетает в себе спинного устройств стабилизации и обезболивающий режим для минимизации дыхательных вызванных движениями и производить необработанные данные изображения, которые не требуют выравнивания или других пост-обработки.

Аннотация

В естественных изображений с помощью двух-фотонной микроскопии ¹ у мышей, которые были генетически выразить флуоресцентных белков в определенных типах клеток ^2-3 значительно расширили наши знания о физиологических и патологических процессов в различных тканях в естественных условиях ^4-7. В исследованиях центральной нервной системы (ЦНС), наблюдается широкое применение в естественных изображений в мозге, который выпустил множество новых и часто неожиданные выводы о поведении клеток, таких как нейроны, астроциты, микроглия, под физиологических или патологических состояний ^8-17. Тем не менее, в основном технические сложности имеют ограниченные реализации в области обработки изображений естественных условиях в исследованиях живой мыши спинного мозга. В частности, анатомическая близость спинного мозга в легкие и сердце генерирует значительные артефакты движения, что делает изображение живым спинного мозга сложной задачей. Мы разработали новый метод, который позволяет преодолеть ограничения, присущие спинного изображений шнура путем стабилизации позвоночника, уменьшения дыхательных вызванных движениями и тем самым облегчая использование двух-фотонной микроскопии для изображения мыши спинного мозга в естественных условиях. Это достигается путем объединения индивидуальных спинного устройство стабилизации с методом глубокого наркоза, что привело к значительному сокращению дыхательных вызванных движениями. Это видео протоколе показано, как предоставить небольшой участок живой спинного мозга, которые могут быть сохранены в стабильных физиологических условиях в течение длительного периода времени, сохраняя повреждения тканей и кровотечение к минимуму. Представитель сырых изображений, полученных в естественных деталей в высоком разрешении тесную связь между микроглии и сосудов. Timelapse последовательность показывает динамическое поведение микроглии процессов в живой мыши спинного мозга. Кроме того, непрерывное сканирование одного и того же г-кадр продемонстрироватьс выдающейся стабильности, что этот метод может достичь для получения стеков изображений и / или timelapse фильмы, которые не требуют выравнивания изображения после приобретения. Наконец, мы покажем, как этот метод может быть использован для пересмотра и Reimage же участок спинного мозга на более поздних timepoints, что позволяет для продольного исследования текущих физиологических или патологических процессов в живом организме.

протокол

1. Строительство спинного устройство стабилизации

1. Заказ Narishige STS-Компактный спинного мозга и зажимы Narishige MA-6N голову холдинга адаптера.
2. Custom спроектировать и изготовить из нержавеющей стали плите провести два Narishige частей в соответствие так, что голова животного поддерживается в то время как позвоночник и хвост зажат. Имейте в виду, что все устройства должны помещаться под микроскопом линзы обычно на снизил столик микроскопа.

2. Животное хирургии

1. Разогреть микроскоп камеры с устройством подогрева воздуха и поддерживать его при температуре 37 ° C.
2. Взвешивание животных и сделать обезболивающий смеси с использованием 100 мг кетамина, 15 мг ксилазина и 2,5 мг acepromazine на кг массы тела, разводят в 0,9%-ный раствор NaCl в стерильных условиях.
3. Анестезию животного путем введения анестетика смеси (KXA) внутрибрюшинно. Регулярные щипать ноги должны быть выполнены для обеспечения глубокого наркоза всейэксперимента. Дополнение с половиной исходной дозы почасовая или по мере необходимости.
4. Используйте маленькую грелку животных для обеспечения тепловой поддержку при выполнении хирургического вмешательства.
5. Применение искусственного мазь слезы на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы и повреждений.
6. Бритье спине животного сначала с отделкой устройство, а затем с острым лезвием, чтобы полностью удалить волосы из области вокруг разреза.
7. Удалить бритые волосы и дезинфицировать бритая поверхности кожи с алкоголем площадку.
8. Выполните мала (~ 1,5 см) продольный разрез кожи над желаемой спинального уровня (грудных позвонков показано здесь).
9. Expose мускулатуры в области спины, тщательно втягивания подкожной ткани соединительной.
10. Аккуратно отделите от паравертебральных мышц позвоночника на желаемом уровне. Выполните как можно меньше разрезов, чтобы отделить мышц с обеих сторон каждого остистого отростка, а затем очистить отдельные мышцыпуть от ламинарного поверхности.
11. Выберите пластинки, которые будут удалены и подготовить участки запись для спинного зажимы с каждой стороны позвоночника, сразу ростральной, а также каудально ламинэктомия. Тщательно перемещать мышечной ткани, чтобы сделать четыре кармана, где зажимы будет вставлен.
12. Поднимите позвоночника с прямым зубчатым наконечником щипцы для безопасного вставки изогнутыми тупыми ножницами кончик под пластинки, не прикасаясь к спинному мозгу. Выполните ламинэктомии медленным резки костей с одной стороны, а затем на другой стороне.
13. Используйте ватный тампон или вставить нарезанные небольшие gelfoam рассасывающиеся желатин части губки рядом с разрезами для ограничения незначительных кровотечений. Используйте маленькую cauterizer судно контролировать дальнейшее кровотечение, если это необходимо. Использование предварительно нагретую стерильной искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) мыть ткани.

3. Стабилизация позвоночника и подготовки для прижизненного изображения

1. Plac электронной животное на высоте накладка на опорную плиту спинного устройств стабилизации и безопасности головы в голову проведение адаптера.
2. Место спинного зажимы STS-устройства вдоль передне-задней оси животных в заранее подготовленные карманы фланговые ламинэктомия (рис. 1). Два зажима должен быть помещен под углом ~ 45 ° по отношению к rostro-каудальной оси животного, чтобы обеспечить достаточное пространство для снижения объектив погружения в воду над открытыми для спинного мозга (рис. 1).
3. Место третий зажим STS-устройства на базе хвост так, тела животного может быть приостановлено в воздухе после удаления высоты площадки для продолжительности визуализации экспериментов (рис. 1).
4. Построить небольшой яме Gelseal (Amersham Biosciences Corporation) вокруг подвергаются спинного мозга для облегчения обслуживания спинного мозга в ACSF и погружение микроскопа линзы в этом решение для визуализации в естественных условиях.

jove_title "> 4. В естественных изображений мыши спинного мозга с двухфотонной микроскопии

1. Передача животных на спинной устройство стабилизации в разогретой камере покрытие микроскопа и закрепите ее на столик микроскопа снизил размещение ламинэктомии прямо под объективом (рис. 1).
2. Нижняя воды погружения линз тщательно в раствор ACSF убедившись, что он не касается спинного зажимов или Gelseal.
3. Используйте epifluorescence определить сферу интересов и сосредоточиться на нем. Переключение в режим лазерного сканирования и выполнять в визуализации естественных используя соответствующие двухфотонного лазерного возбуждения длины волны, dichroics и полосовой фильтры для флуорофоров присутствует в отображаемого ткани.

5. Повторные обработки изображений и послеоперационного ухода

1. В конце эксперимента изображения, удалять мышь от спинного устройств стабилизации и тщательно протрите Gelseal из области вокруг ламинэктомия.Очистите место должно быть хорошо.
2. Восстановление и шовный мышцы спины более ламинэктомия.
3. Восстановление и шовный кожа над ламинэктомии, тампоном его с бетадин.
4. Предоставление 1 мл лактата Рингера раствор (Baxter Healthcare) в качестве дополнения питательных веществ и гидратации, а также болеутоляющее лечение подкожно (0,1 мг / кг бупренорфина).
5. Администрирование антисептическим внутрибрюшинно лечения (0,03 мл на мышь, 2,27% энрофлоксацина инъекционный антибактериальный раствор).
6. Место животное на грелку до полного восстановления после анестезии, а затем дом его индивидуально.
7. Повторите антисептическим администрации в день в течение первых 3-5 дней после операции и обезболивающее лечение каждые 8-12 часов в течение 2-3 дней после операции. Монитор животных ежедневно, чтобы обеспечить нормальное поведение и полное выздоровление.
8. Для повторного изображения через те же ламинэктомии, возобновить зашивается кожу и мышцы и повторите действия, описанные в разделах 2 - 4.
9. Повторно найти previously отображаемого области с помощью крови сосудистую как карту, как описано выше ^10.

6. Представитель результаты

Все животные процедуры проводились под руководящих принципов, установленных институциональных уходу и использованию животных комитетов в Университете Калифорнии, Сан-Франциско и в соответствии с Федеральным нормам. Картину спинного устройств стабилизации и схематическое расположение мыши на устройство под микроскопом линзы показано на рисунке 1. Разрешение достаточно места для дыхания движений под тело животного обеспечивает стабильность в естественных изображений в спинной мозг. На рисунке 2 показана тесная связь между микроглии и сосудистая сеть, как это было отображается в естественных условиях в спинной мозг Cx3cr1 ^{GFP / +} трансгенных мышей, ^18, , в которой микроглия являются эндогенно помечены GFP. На рисунке 3 показаны примеры повторяющихсяв естественных изображений, как она была исполнена в той же области спинного мозга в мышей, экспрессирующих флуоресцентного белка в спинномозговой аксонов (YFP-H строка ³⁾ и микроглии (в Cx3cr1 ^{GFP / +} мышей).

Рисунок 1. Стабилизация мыши позвоночника для прижизненного изображения с помощью двух-фотонной микроскопии. (А) на заказ стальной опорной плитой используется для поддержки и выровнять STS-Narishige компактные зажимы спинного мозга и MA-6N Narishige глава холдинга адаптера, как показано здесь. (В) Правильное расположение взрослых трансгенных мышей анестезировали KXA анестетика на спинной устройство стабилизации. Вставке показаны размещения спинного зажимы сразу рострально и каудально к ламинэктомии и подвергаются ткани спинного мозга.

Рисунок 2. В естественных изображений с высокой плотностью клеток микроглии и кровеносные сосуды в спинной мозг мышей под наркозом. Прогнозируемые но неприсоединившиеся Z-стеки (А) высокой плотности GFP-положительных микроглии (зеленый) в спинной мозг CX3CR1 ^{GFP / +} мышь в непосредственной близости с кровеносными сосудами (красные, помечены внутривенного введения родамина декстран). (Б) Высокая увеличения изображения помечены как в () одного микроглии клетка прикрепляется к стене из кровеносного сосуда с процессами расширенного вокруг судна и в сторону спинного паренхимы мозга. Шкала баров, 10 мкм.

Рисунок 3. Повторяющиеся в естественных изображений одного и того же аксонального сегментов и микроглии, как они были переселены и reimaged в спинной мозг мышей под наркозом в разные дни. (А) YFP-лабораторию eled аксонов на 0 и 5. (B). Же сосудистых структур и клеток микроглии вокруг них отображается в естественных условиях в спинной мозг Cx3cr1 ^{GFP / +} мышей на 0 и 1. Шкала баров, 10 мкм.

Фильм 1. Представителю timelapse последовательность приобретенные в естественных условиях от спинного мозга мыши. Эта последовательность показывает, подробно штраф микроглии динамику процесса (зеленый) и их взаимодействие с сосудистой (красный, помечены внутривенного введения родамина декстрана) с течением времени в ткани густонаселенных с люминесцентными структур. Необработанных изображений только с поправкой на фоновый шум, яркость и контрастность и timelapse фильм был построен на г-проектирование последовательно приобрела стеков изображения, без выравнивания изображения, в среднем или Z-выбор отдельных плоскостях. Кровеносные сосуды проходят через подобный спектр плоскостей г как образы микроглии. Z плоскости глубина: 38 мкм.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 2. Timelapse последовательность демонстрации сырья стабильность изображения методом на уровне одного г-плоскости. Быстрый захват одного и того же одной плоскости г, в спинном мозге CX3CR1 ^{GFP / +} мышей помещается на спинной устройство стабилизации под наркозом KXA, демонстрирует минимальное смещение изображения между последовательными кадрами при сканировании со скоростью 1 кадр / с, что быстрее, чем частота дыхания мыши. Незначительных остаточное смещение связано, вероятно, сердцебиение. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод, описанный здесь сохраняется стабильная и повторяющихся в естественных изображений густонаселенных флуоресцентные клеточных структур в спинной мозг мышей под наркозом с помощью двух-фотонной микроскопии. Достигнутая стабильность является результатом заказ спинного уст?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Родамина Б декстрана	Invitrogen	D1841	70 кДа, разбавленных в ACSF (3% вес / объем)
Кетамин HCl	Bionichepharma	НДЦ No: 67457-001-10	Инъекций, 50мг/мл
Anased	Ллойд Labs	NADA No: 139-236	Ксилазин инъекций, 20mg/ml
Acepromazine	Vedco	NADA No: 117-531	Инъекций, 10mg/ml
Искусственные слезы мазь	Феникс фармацевтический	НДЦ No: 57319-760 - 25	Смазка
Бетадин	Рыболов	19-061617
Макферсон-Уэсткотт Ножницы	Всемирный Precision Инструменты	555500S	Изогнутые, тупым наконечником ножницы
Прямой пинцет	Всемирный Precision Инструменты	555047FT	Зубчатые пинцетом кончик
Малый сосуд прижечь	Инструменты изобразительных наук	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, Pfizer Inc	Вибрационная мельница MM400
Компактный спинного мозга Зажимы	Narishige	STS-
Глава холдинга адаптер	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Корпорация Biosciences	80-6421-43
Лактата Рингера	Baxter Healthcare	2B8609
Buprenex	Reckit Benckiser Фармацевтическая продукция Inc	НДЦ №: 12496 - 6757-1	Бупренорфин, инъецируемый
Baytril	Bayer	NADA 140-913	Энрофлоксацин, антибактериальные инъекционные 2,27% (20 мл)
Отопление площадке - Большой	Инструменты изобразительных наук	21060-10