Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Резюме

Мы представляем наш оптимизированный для высокой пропускной nucleofection протокол как эффективный способ трансфекции первичных человеческих моноцитарных дендритные клетки либо с плазмидой ДНК или миРНК, не вызывая клетка созревания. Мы также предоставить доказательства для успешного глушителей миРНК целевой ген RIG-I как на РНК и белка.

Аннотация

Дендритные клетки (ДК) можно рассматривать часовых иммунной системы, которые играют важнейшую роль в его возбуждении и реакции на инфекцию ^1. Обнаружение патогенных антигена наивно домена через распознавания образов рецепторы (РРСС), которые способны распознавать определенные сохраняющиеся структуры называются патоген-связанные молекулярные модели (PAMPS). Обнаружение PAMPs по РС вызывает внутриклеточный сигнальный каскад в результате чего их активации и перехода к зрелой DC. Этот процесс, как правило, характеризуется производство интерферона типа 1, наряду с другими провоспалительных цитокинов, регуляция клеточных поверхностных маркеров, таких как MHCII и CD86 и миграцию зрелых постоянного тока для слива лимфатические узлы, где взаимодействие с Т-клетки, инициирует адаптивного иммунного ответа ^{2, 3.} Таким образом, контроллеры домена ссылку врожденной и адаптивной иммунной системы.

Способность анализировать молекулярные сети постоянного тока основной ответ на различные патогенные имеет решающее значение для лучшего понимания регулирование этих сигнальных путей и их индуцированных генов. Он также должен способствовать развитию округ Колумбия, вакцин против инфекционных заболеваний и опухолей. Тем не менее, это направление было сильно мешают трудности трансфекции первичных контроллерах домена ^4.

Вирус трансдукции методы, такие как лентивирусов системы, как правило, используются, но имеют много ограничений, таких как сложность и биологически опасных рисков (с соответствующими затратами) ^5,6,7,8. Кроме того, доставка продуктов вирусного гена увеличивает иммуногенность тех трансдуцированных домена ^9,10,11,12. Электропорация была использована со смешанными результатами ^13,14,15, но мы первыми сообщили использование высокой пропускной трансфекции протокол и убедительно доказать свою полезность.

В этом докладе мы суммируем оптимизированных коммерческих протокол для высокой пропускной трансфекции первичных человеческих DC, с ограниченным токсичности клеток и отсутствие постоянного созревания ^16. Трансфекция эффективности (GFP из плазмиды) и жизнеспособности клеток были более чем на 50% и 70% соответственно. FACS анализ установленных отсутствие увеличения выражение созревание маркеров CD86 и MHCII в трансфекции клеток, а QRT-PCR, не выявили регуляция IFNβ. Используя этот протокол электропорации, мы предоставляем доказательства для успешной трансфекции миРНК с контроллерами домена и эффективной сбить целевой ген RIG-I, ключевых вирусных рецепторов признание ^16,17, как на РНК и белка.

протокол

1. Программа Amaxa 96 и трансфер Nucleofector

1. Откройте новый файл параметров.
2. Выберите количество скважин вы будете использовать для стандартных трансфекции, перемещая курсор на 96 лунок диаграмме пластины. Используйте не менее 3 скважин бассейн для каждого экспериментального образца.
3. Введите код программы: в part1 выберите 'FF' и в part2 выберите '168 'из выпадающего меню
4. С Решения окне выберите "Моноцитарный, человеческое '
5. Под контролем Вариант выбора "стандартный".
6. Нажмите на Apply.
7. Чтобы включить не трансфекции управления, выберите дальнейшего скважин из диаграммы по мере необходимости, а затем выберите "Нет программы борьбы с 'из управления Вариант и нажмите на кнопку Apply.
8. Выберите любые остающиеся неиспользованными скважин на пластине диаграммы и нажмите на Undefine.

2. Подготовка домена для трансфекции

1. Все работы должны производиться в стерильных условиях в капот культуре клеток, где это возможно. Подготовка nucleofection решение, добавив 96-а дополнением к человеческих моноцитов 96-луночного Nucleofector решение в соотношении 450 к 2025 году. Перемешать и дать прогреться до комнатной температуры. Вам понадобится 20 мкл nucleofection решение на лунку. Сделать более 10%, чтобы учесть ошибки пипетирования.
2. Место количество модулей nucleocuvette вам нужно в пластину nucleocuvette в правильной ориентации, т.е. вставив первый в к строкам 1 и 2.
3. Определить количество контроллеров домена, необходимые для вашего эксперимента в расчете на 500 000 клеток на лунку и гранул путем центрифугирования при 400g в течение 10 минут. Осторожно удалите супернатант.
4. Ресуспендируют клеток в nucleofection решение, мягко пипетирования вверх и вниз несколько раз.
5. Разделите правильный объема ресуспендировали клеток в eppendorfs предназначенного для конкретного лечения, например, GLO и RIG-I.
6. Добавить 0.25μg миРНК в клетки 500000 и перемешать с помощью пипетки. Используйте ненацеливании миРНК в не-трансфекции контрольного образца.
7. Внесите 20 мкл выше смесей в модулях nucleocuvette, в соответствии с вашими Схема экспериментальной установки, обеспечивая жидкость подается на дно колодца.
8. Обложка nucleocuvette пластины с крышкой и нажмите на пластину на твердую поверхность несколько раз, чтобы обеспечить удаление пузырьков воздуха.

3. Трансфекции домена

1. Вставьте пластину в Nucleofector 96-луночного трансфер лоток, нажмите на Загрузить и запустить.
2. Следуйте прогресса трансфекции процесса на дисплее верхней коленях; черный крест на зеленом фоне означает успешное трансфекции в том, что хорошо, в то время как черная полоса на красном фоне означает, что она была неудачной.
3. По завершении процесса трансфекции, удалить пластину и добавить 80μl среднего роста DC в каждую лунку помощью многоканальной пипетки.
4. Инкубируйте пластине в течение 10 мин при 37 ° С и 5% СО _2.
5. Передача 100 мкл объемом от nucleocuvettes в матрицу пробирки, содержащие 100 мкл подогретого среднего роста, округ Колумбия, поддержание правильной ориентации.
6. Удаляют тех пробирках, где трансфекции не произошло.
7. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 24 часов или другого желаемого интервала времени.

4. Инфицировать клетки с НДВ

1. Удалите матрицу труб из инкубатора в капот культуре клеток и бассейн трубы для каждого экспериментального образца в eppendorfs
2. Гранул клетки осторожно, крутя в центрифуге верхней палубе, в течение 5 минут и удалить супернатант.
3. Ресуспендируют клетки в бессывороточной роста среде, содержащей НДВ в МВД 1 и инкубировать при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 45 мин, при eppendorfs слабо покрыта стерильной моды.
4. Добавить 900μl среднего роста, округ Колумбия, и вновь инкубировать в течение 8-10 ч.

5. Урожай клетки

1. Гранул клеток спиннинг eppendorfs в центрифуге верхней палубе, и удалите супернатант.
2. Урожай клеток на РНК или белка добычи в соответствии с вашим протоколом.

6. Представитель результаты:

Используя наш оптимизированный протокол мы трансфицированных контроллеры домена с Риги таргетирования миРНК в течение 24 ч, после чего инфицированные клетки с НДВ (парамиксовирус обнаружены RIG-I), чтобы стимулировать пути интерферона ответ. По QRT-PCR анализа мы показали, сбить гена на 75% на уровне транскрипции. Мы также наблюдали похожее сокращение выражения IFNβ, которая ниже по течению эффектор RIG-I в каскаде ИФН сигнализации. Кроме того, мы обнаружили, что выражение IFNβ в неинфицированных, контрольно-трансфекции клеток не обнаруживается в то время как MXA, IFNβ вниз по течению гена ответ, было минимальным (рис. 1А).

Второй трансфекции домена с Риги таргетирования миРНК проводили с использованием достаточное количество клеток для включения Западной блоттинга. ГдеRT-PCR результаты были похожи на то, что мы видели ранее (62% и 66% сбить из RIG-I и IFNβ выражении соответственно) (рис. 1Б), иммуноблоттинга исследовали на RIG-I показало, что экспрессия этого гена была полностью блокирован (рис. 1в).

Рисунок 1. (А) MoDCs трансфицируют либо миРНК ориентации RIG-I или неспецифических миРНК GLO и влияние на экспрессию RIG-I, IFNβ и MXA определяется QRT-PCR. Трансфекции протокол, используемый моноцитов конкретного буфера и nucleoporation программы FF168 (Lonza Уолкерсвилл Inc) После инкубации в течение 24 ч, трансфекции клетки либо были инфицированы НДВ (+) или влево неинфицированных (-). После дальнейшей инкубации в течение 10 ч, клетки собирали и РНК, выделенная уровней Стенограмма представляют результаты двух повторить эксперименты. Взято из Боулз и др. ^16. (В) MoDCs получены из различных пальто Баффи, который используется для рис. 1А снова трансфицированных либо RIG-I-таргетинга миРНК или неспецифических миРНК GLO, используя тот же протокол трансфекции как указано выше. Дополнительного контроля с использованием untransfected MoDCs был включен в эксперимент. После 24 ч инкубации все клетки были инфицированы НДВ и инкубировали в течение еще 10 ч до сбора урожая и для РНК и белка добычи. Стенограмма уровней RIG-I, IFNβ и MXA, как это определено QRT-PCR представляют результаты двух повторить эксперименты. Взято из Боулз и др. ^16. (С) Лизаты из клеток показано на рисунке 1b выше, были проанализированы иммуноблоттинга. Дорожки 1 и 2, из лизатов untransfected клеток; полосы 3 и 4, лизатов от GLO миРНК трансфекции клеток; полосы 5 и 6, лизатов из клеток, трансфицированных RIG-I-таргетинга миРНК. Образцы были исследованы на RIG-I, а также GAPDH (как погрузка контроль) и проводились в двух экземплярах. Взято из Боулз и др. ^16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эффективность трансфекции наивно первичных дендритных клеток имеет важное значение для высокой пропускной способности и анализа инженерный клеточных воспалительных путей в этой ключевой ячейки посредническую врожденной-адаптивной иммунной перехода. Тем не менее, большинство иссл?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Оборудование / реагент	Компания	Catalogue #	Комментарии
Amaxa Nucleofector 96-луночного Трансфер	Lonza	108S0109	Серийный номер
Amaxa человеческих моноцитов 96-луночного Nucleofector Kit	Lonza	VHPA-2007	Содержит человеческих моноцитов 96-луночного Nucleofector Solution, 96-а дополнения и Nucleocuvettes и плит
RIG-I миРНК	Dharmacon	L-012511-00
GLO миРНК	Dharmacon	Д-001600-01-20
RPMI 1640	Invitrogen	11875	С добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, чтобы сделать DC ростовой среде
DMEM	Invitrogen	11965
L-глютамин	Invitrogen	25030081
Пенициллин / стрептомицин	Invitrogen	15070063
Фетальной телячьей сыворотки	Hyclone	3070,03
Дендритные клетки	Нью-Йорк Центр крови		РС очищают от слоя кровяного сгустка использованием стандартной процедуры