Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований

Резюме

Дендритные поглощение клетками антигены и мигрировать в органах иммунной системы в настоящее время обрабатываются антигенов Т-клеток. Qdot нанокристаллов маркировка обеспечивает длительную и стабильную флуоресцентный сигнал. Это позволяет отслеживать дендритных клеток в различных органах методом флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген представляющих клеток (БТР) обнаружили в периферических тканях и в иммунологических органов, таких как вилочковая железа, костный мозг, селезенку, лимфатические узлы и патчи Пейера ^1-3. РС присутствуют в периферических тканях образец организма на наличие антигенов, которые они занимают, обработки и представления в их поверхности в контексте крупных молекул гистосовместимости (MHC). Затем антиген-загружалась домена перейти на иммунологические органах, где они представляют обработанные антигена Т-лимфоцитов запуска специфических иммунных реакций. Один из способов оценки миграционных возможностей контроллеров домена является маркировать их с флуоресцентными красителями ^4.

При этом мы демонстрируем использование Qdot флуоресцентных нанокристаллов для обозначения мышиный мозг происхождения кости, округ Колумбия. Преимущество этой маркировки является то, что Qdot нанокристаллов обладают стабильной и долговечной флуоресценции, что делает их идеальными для обнаружения меченых клеток в восстановленных тканей. Чтобы достичь этого, первые клетки будут восстановлены из мышиных кабачки кости и культивировали в течение 8 дней в присутствии макрофагов гранулоцитов-колониестимулирующий фактор для того, чтобы побудить DC дифференциации. Эти клетки затем будут помечены флуоресцентным Qdots короткой инкубации в пробирке. Витражи клетки могут быть визуализированы с флуоресцентной микроскопии. Клетки могут быть введены в экспериментальных животных в этот момент или может быть в зрелые клетки в пробирке после инкубации с воспалительными стимулами. В наших руках, округ Колумбия созревания не определяли потерю флуоресцентный сигнал и не Qdot окрашивание влияют на биологические свойства домена. После инъекции этих клеток могут быть идентифицированы в органах иммунной системы методом флуоресцентной микроскопии следующие типичные рассечения и фиксации процедур.

протокол

1. Препарирование мышей бедра и голени и культуры клеток костного мозга

1. Жертва 2 мыши СО ₂ удушья и тщательно анализировать большеберцовые кости и бедра, не сокращая кости концами.
2. Чистая кости из всех подключенных тканей с помощью папиросной бумаги. Будьте осторожны, чтобы не сломать кости.
3. Стерилизовать кости путем погружения в 70% этаноле в течение 10 мин в 35 мм чашки Петри. С этого момента работа внутри капота биобезопасности, чтобы избежать загрязнения клеточных культур.
4. Восстановление кости из этанола и позволить им высохнуть на воздухе в течение 5 минут в чашке Петри внутри шкафа биобезопасности.
5. Вырезать бедра в два раза, и голени его тонкий кончик. Настаивать внутри кости с 1 мл среды RPMI (без сыворотки, но с антибиотиками) с помощью стерильного шприца на стерильную чашку Петри.
6. Клеточной суспензии собираются и промывают 2 раза в среде RPMI на 10 мин центрифугирования в центрифуге 15 трубки мл при 1100 оборотов в охлажденном центрифуги (4 ° С), размахивая ведром ротора.
7. После последней стирки, ресуспендирования клеток в 2 мл буфера для лизиса ACK, инкубировать 5 минут при комнатной температуре в целях устранения красных кровяных телец.
8. Добавить 13 мл RPMI с 10% FBS, ресуспендирования и мыть 2 раза в этой среде с теми же настройками, как описано в 1.6.
9. Граф клеток, приспособиться к 2 х 10 ⁵ клеток / мл RPMI 10% FBS, а также добавить RM-GM-CSF (20 нг / мл, конечная концентрация) ^5.
10. Добавьте 10 мл этой суспензии в стерильной, микробиологического качества, 10 см, чашка Петри, и культуры в CO ₂ инкубаторе (37 ° C, 5% СО _2).
11. Три дня спустя, добавьте еще 10 мл RPMI 10% FBS с 20 нг / л rmGM-КСФ на каждом из подготовленных пластин.
12. Через три дня 10 мл клеточной суспензии взыскиваются с каждой чашке Петри, центрифугируют, как в 1.6, ресуспендировали в том же объеме RPMI 10% FBS с rmGM-CSF и вернулся в чашке Петри. Клетки культивировали в течение 2 дополнительных дней в CO ₂ инкубаторе.

2. Сбор и маркировка РС

1. Через 8 дней в культуре слабо прилипшие клетки восстанавливаются промывкой чашки Петри со свежей средой. Этот протокол предоставляет около 2-4 x10 ⁸ контроллеров домена в наших руках. Клетки могут быть проанализированы на фенотип DC с помощью проточной цитометрии.
2. Сборник Затем клетки помечены Qtracker 655 Сотовые Маркировка Kit строго следуя инструкциям производителя.
3. Мы получили отличные результаты маркировки мышиный мозг происхождения кости контроллеры домена с Qdots на 10 нМ концентрации. Чтобы достичь этого, аликвоты Qtracker клеточных компонентов Маркировка Kit и Б смешивают в равных объемах, инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, и сразу же разбавленного 1 / 100 в свежую среду с вортексе в течение 30 сек
4. Чтобы пятна 5 х 10 ⁶ DC, смешайте 5 мкл каждого комплекта компонентов А и В в пробирку Эппендорфа и инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 1 мл RPMI инкубировать 10% FBS, и вихрь в течение 30 секунды.
5. Добавить 0,5 мл клеточной суспензии, содержащей 5 x10 ⁶ контроллеров домена, и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин.
6. Затем вымыть клетки 2X в RPMI 10% FBS (1100 RPM). Клетки могут быть ресуспендировали в RPMI для дальнейшего культуры или в ФБР для инъекций в экспериментальных мышей.

3. Оценка меченых DC

1. Сотовые маркировки может быть оценена с помощью флуоресцентной микроскопии. Для этого каплю суспензии клеток добавляется в стекло микроскопа, покрытое стекло покровное, и оценивается с флуоресцентным микроскопом, принимая во внимание, что эти Qdots имеют излучения и спектров возбуждения 565nm и 405-525nm соответственно (рис. 3 )
2. На данный момент, меченые клетки могут быть использованы для введения животным или созревания могут быть вызваны путем инкубации этих клеток в течение 48 ч (37 ° C, 5 CO ₂₎ в присутствии ЛПС (100 нг / мл) и ФНО-( 20 нг / мл). Флуоресцентная маркировка не зависит от постоянного созревания (рис. 4).

4. Представитель Результаты:

При этом мы рассказали, как подготовить мышиный мозг происхождения кости контроллеры домена и как обозначил их с люминесцентными Qdots. Рис. 1 приведены процедура получения клетки, а на рис. 2 представлена ​​процедура оформления с Qdots. Как показано на рис. 3, почти все клетки помечены этой процедуры, и это не зависит от постоянного созревания при воспалительных факторов (рис. 4). Рис. 5 показывает, что Qdot окрашенных РС (Fig.5a) ведут себя подобно не-окрашенных клеток при лечении воспалительных коктейль. Оба клеточных препаратов аналогичным upregulate выражение костимуляторных молекул (рис. 5, б), а также производить одинаковое количество IL-6 (рис. 5) и оксида азота (рис. 5, г) при созревании раздражители. Это согласуется с previПодразделения опубликованы данные о том, что окрашивание Qdot не влияет на возможность постоянного превращаться в зрелые клетки способны вызвать иммунный ответ [6]. Эти клетки затем можно использовать для введения экспериментальным животным. Как показано на рис. 6, 2-х дней после внутривенного введения меченого контроллеры домена в мышей, мы были в состоянии обнаружить Qdot-окрашенных клеток в селезенке. Это также согласуется с ранее опубликованные данные, показывающие использование Qdot нанокристаллов для оценки миграции постоянного тока в естественных условиях [6] неинвазивной визуализации и проточной цитометрии.

Рисунок 1. Блок-схема DC поколения из костного мозга. При этом мы изобразить процесс получения костномозгового происхождения постоянного тока. Оба большеберцовые кости и бедра расчленены и очистить от окружающих тканей. Кость советы сохранились и интерьер кости сбрасываются со средой. После устранения красных кровяных клеток, клеток костного мозга выращивают в течение 8 дней в присутствии GM-CSF, чтобы отличить их на РС.

Рисунок 2. Блок-схема процедуры маркировки. Равные аликвоты Qtracker клеточных компонентов Маркировка Kit и B должны быть смешаны в трубке Эппендорф. Дендритные клетки собираются с 8-дневным костного мозга культур с ГМ-КСФ и смешивается с маркировки красителя в течение 60 минут при температуре 37С. Затем клетки промывают в средствах массовой информации по ликвидации избыточных частиц маркировки.

Рисунок 3. Флуоресцентные микрофотографии ДК сразу после маркировки. Капля меченых клеток наносили на предметное стекло и покрывается покровным. Затем образцы были оценены в флуоресцентный микроскоп и изображения были приобретены в результате Micropublisher 5,0 Цифровой CCD цветная камера (Qimaging, графство Суррей, Британская Колумбия, Канада).

Рисунок 4. Флуоресцентные микрофотографии ДК после 48 ч созревания в лабораторных условиях. Маркированный домена культивировали в течение 48 ч с LPS (100 нг / мл) и ФНО-α (20 нг / мл) на стеклах на СО ₂ инкубатора (37 ° C, 5% СО _2). Затем образцы промывают PBS (5 мин, 2X), фиксированный с ацетоном (15 мин, 4 ° С) и контрастно с DAPI. Клетки были оценены в флуоресцентный микроскоп как указано выше.

Рисунок 5. Биологическая активность Qdot окрашенных зрелых ДК. Маркированный домена созрел в пробирке, как выше, были проанализированы с помощью проточной цитометрии (А) и (Б). (А) Qdot-окрашенных клеток дают сильный сигнал в FL3 (PercP) канала. Затененные гистограммы: неокрашенных контроля. (B) Qdot окрашенных и неокрашенных домена были дополнительно окрашивали специфических антител против созревание маркеров CD86 и CD40, а изотипа управления. Клетки затем анализируются в цитометр FACSort потока (Becton Dickinson, San Jose, CA). Кроме того, ИЛ-6 (С) и оксида азота (NO) были определены в супернатантах зрелых Qdot окрашенных ДК и контроля. Уровни ИЛ-6 и оксида азота определяли с помощью ELISA анализа и анализа Грисса как мы уже ранее описанных ^{7, 8.} Все данные показали, на этом рисунке является представителем двух или трех независимых экспериментов показывает аналогичные результаты. Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа GraphPad программного обеспечения.

Рисунок 6. Обнаружение меченых контроллеры расчлененный тканей. Маркированный зрелых РС (1x10 ⁶ клеток) были внутривенно вводят в C57BL / 6 мышей. (А) Через два дня мышей умерщвляли и селезенки собраны, оснастки заморожены, встроенные в октябре, и 8 мкМ разделы подготовлены с использованием криостата. Затем образцы были зафиксированы с помощью ацетона (15 мин, 4 ° С) и контрастно с DAPI. Клетки были оценены в флуоресцентный микроскоп, как и выше рис 6а. 40х увеличением, рис 6б: 100X увеличение, рис. 6С, 400X увеличении.

Обсуждение

Мышей миелоидной) РС широко используются в целях определения эффективности и улучшение округ Колумбия, вакцин; исследовать DC: Т-клеток взаимодействия или постоянного развития, и определить их роль в различных болезней ^9-11. При этом мы показываем, как для создания домена из предшественников оправился от костного мозга от большеберцовые кости и бедра. Мы восстановления костей без разреза советы, позволяющие стерилизовать их погружение в этанол 70%, тем самым снижая вероятность заражения. Чтобы дифференцировать РС из клеток костного мозга мы используем только GM-CSF, как описано выше ^5. Хотя некоторые протоколы также использовать Ил-4, было сообщено, что этого цитокина не является обязательным при работе с высоким уровнем ГМ-КСФ ^12. В самом деле, мы уже показали, что эти контроллеры домена могут вызывать иммунный ответ ^13. Кроме того, помощь должна быть предприняты для восстановления лишь слабо прилипшие клетки из 8-дневных культур промывкой чашки Петри со средним поскольку прилагается клетки показывают более моноцитов-подобный фенотип. Здесь мы показываем, маркировка РС с флуоресцентными частицами Qdot. Это маркировка имеет некоторые преимущества по отношению к другим методам. Во-первых, Qdots частиц вещества легко внедряются в клетки. Во-вторых, флуоресцентный сигнал очень высок и не меняется при созревании постоянного тока. В-третьих, флуоресценция не теряется, когда клетки или ткани крепятся с помощью растворителей, таких как ацетон, вопреки тому, что произойдет, если GFP используется для тега РС ^14, что дает большую гибкость в момент выбора окрашивания протоколы. Наконец, высокий флуоресцентный сигнал, предоставляемых этими частицами позволяет выявлять клетки, несмотря на ткани авто-флуоресценции. Как описано выше ^6, Qdot окрашивание не влияет созревание способность этих клеток. При этом мы показываем, что Qdot окрашенных РС ведут себя таким же образом, как не окрашенные DC, upregulating костимуляторных молекул, и производство IL-6 и оксида азота в ответ на воспалительные стимулы. Хотя контроллеры домена являются клетки, специализированные в запуске иммунного ответа, они были показаны на участие в патологических состояний, таких как рак и атеросклероз ^{4, 15, 16.} Они также утверждали, участвовать в процессе ангиогенеза ^{17, 18,} ​​даже предположил, как структурно, участвующие в разработке новых судов ^{19, 20.} Таким образом, методы, которые позволяют для постоянного слежения в естественных условиях, а также определение их географической локализации в различных тканях ^{4, 21, 22} являются очень ценными.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
C57BL / 6 мышей	Джексон лабораторий		Женщины, 6-8 недель
RPMI	Invitrogen	11875-119
Фетальной телячьей сыворотки, квалифицированные	Invitrogen	10437-028
Антибиотик-противогрибковым	Invitrogen	15240-096
PBS	Invitrogen	10010-049
ACK буфера Лизирующий	Lonza Уолкерсвилл, Inc	10-548E
Рекомбинантный мышиный GM-CSF	PeproTech Inc	315-03
Qtracker 655 Сотовые Маркировка Kit	Invitrogen	Q25021MP
Липополисахарида	Invivogen	tlrl-eblps
Рекомбинантный мышиный TNF альфа	Peprotech	315-01A
CD86 антител	BD Biosciences	553691
CD40 антител	BD Biosciences	553791
Грисса системы реагента	Promega	G2930
ИЛ-6 захвата антител	eBioscience	13-7061-81
ИЛ-6 обнаружения антител	eBioscience	13-7062-81