HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

Резюме

Новый DC независимым методом индукции и расширения антиген-специфические Т-клетки описывается. HLA A2-Ig основан искусственный антиген представляющих клеток (AAPC) загружаются с HLA-A2 ограничено пептиды эффективно расширить CTL различной специфичности антигена. Эта технология имеет большой потенциал для CTL основе приемных иммунотерапии.

Аннотация

CTL с оптимальным эффекторной функции играют важную роль в посредничестве защиты от различных внутриклеточных инфекций и рака. Тем не менее, отдельные лица могут обладать подавляющей иммунную микросреды и, в отличие от активации ЦТЛ, их аутологичных антиген представляющих клеток может иметь тенденцию к tolerize или anergize антиген специфический CTL. В результате, хотя еще в экспериментальной фазе, CTL основе приемных иммунотерапии развивались, чтобы стать перспективным для лечения различных заболеваний, таких как рак и вирусных инфекций. В начальных экспериментах исключая виво расширен ЦМВ (цитомегаловирус) специфические ЦТЛ были использованы для лечения цитомегаловирусной инфекции у иммунокомпрометированных пациентов аллогенной трансплантации костного мозга. Хотя обычно иметь опасные для жизни виремия ЦМВ у этих пациентов, ни один из пациентов, получающих расширен CTL развивать CMV, связанные с болезнью, подразумевая, анти-ЦМВ иммунитет устанавливается восприимчиво переданы CTL ^1. Обнадеживающие результаты наблюдались также меланомы и может быть распространен и на другие виды рака ^2.

Хотя Есть много способов, чтобы бывшие естественных условиях стимулирования и расширения человеческих CTL, современные подходы ограничены стоимость и технические ограничения. Например, нынешний золотой стандарт основан на использовании аутологичных постоянного тока. Это требует от каждого пациента, чтобы пожертвовать значительное количество лейкоцитов, а также очень дорогой и трудоемкий. Кроме того, подробно изложены в пробирке характеристики DC расширен CTL показала, что они имеют только субоптимальные эффекторной функции ^3.

Здесь мы представляем высокоэффективные AAPC система для бывших расширения естественных условиях на человека ЦМВ конкретных CTL для приемных иммунотерапия (рис. 1). AAPC выступили связи клетка размера магнитных шариков с человека HLA-A2-Ig димера и анти-CD28mAb ^4. После AAPC сделаны, они могут быть загружены с различных пептидов интересов, а также оставаться функциональным в течение нескольких месяцев. В этом докладе AAPC были загружены с доминирующей пептид из ЦМВ, РР65 (NLVPMVATV). После культивирования очищенные человеческие CD8 ⁺ CTL от здорового донора с AAPC в течение одной недели, ЦМВ конкретных CTL могут быть значительно увеличены в специфике до 98% (рис. 2) и усиливаются более 10000 раз. Если более ЦМВ-специфический CTL не требуется, дальнейшее расширение может быть легко добиться, ритмическая стимуляция с AAPC. Фенотипические и функциональные характеристики показывает эти расширенные клетки эффекторных памяти фенотип и достичь существенного количества обоих ФНО и IFNγ (рис. 3).

протокол

1. Создание, HLA-A2-Ig основан AAPC

1. Подготовка стерильного буфера борат
   1. Растворите борной кислоты в воду, чтобы сделать 0,1. Скорректировать значение рН до 7,0.
   2. Фильтра через 0.22μm стерильный фильтр и хранят при температуре 4 ° C.
2. Подготовка стерильного бисера промывочный буфер
   1. Возьмите 956ml PBS без магния или кальция.
   2. Добавить 30 мл человеческой сыворотки АВ.
   3. Добавить 2 мМ ЭДТА конечной концентрации.
   4. Добавить 0.1gsodium азида.
   5. Фильтр по 0,22 мкм стерильный фильтр и хранят при температуре 4 ° C.
3. Возьмите 1 мл Invitrogen М-450 бусин эпоксидной со склада, около 400 миллионов бусины (бисер, можно пересчитать по гемоцитометра), и положить в стерильный, с завинчивающейся крышкой стеклянный пузырек.
4. Поместите флакон против Dynal магнит MPC-1, в то время как бусины придерживаться стороне флакона, удалить супернатант аспирацией. Вымойте бисером один раз с 1 мл буфера борат.
5. Ресуспендируют бисером в смеси 1 мл буфера борат и 20 мкг HLA-A2-Ig димера и 20 мкг анти-CD28 МКА человека (Clone 9.3).
6. Белки к борту сопряжения: положить стеклянные флаконы по ротатора и вращать при 4 ° С в течение 24 часов.
7. Поместите пробирку в MPC-1 магнита и удалить все боратный буфер.
8. Вымойте бисером дважды с 1 мл промывочного буфера из бисера.
9. Инкубируйте бисером в 1 мл промывочного буфера из бисера, вращать при 4 ° С в течение 24 часов. Из бисера промывочного буфера, содержащие человеческую сыворотку AB, он будет блокировать все остаточные связывания с белками сайта на бусы.
10. Удалить супернатант из стекла флакона, заменить 1 мл свежей бисера промывочным буфером.

2. Контроль качества AAPC и пептид размещения, хранения

1. Добавить ~ 5 × 10 ⁵ бусин на 100 мкл промывочного буфера FACS в трубах FACS, и пятна с 1 мкл анти-мышь IgG1-PE (признать Fc части HLA-A2-Ig) и 1 мкл анти-мыши IgG2a-FITC (признать Fc часть анти-CD28 МКА). После окрашивания в течение 20 минут в FACS промывочный буфер, мыть снова и прочитайте результат окрашивания немедленно потока цитометр (рис. 4).
2. Пептид погрузки на бисера: мыть дважды в бисер стеклянный флакон с 1 мл стерильной PBS. Ресуспендируют с 1 мл стерильной PBS затем добавить 10 мкл ЦМВ-пептида (1mg/ml)
3. Граф бисером по гемоцитометра, и этикетку флакона с указанием даты и концентрации.
4. AAPC готовы к использованию после по крайней мере 3 дня пептид инкубации при 4 ° С, чтобы было достаточно времени пептидных обязательным на HLA-A2-Ig димера. Бисера можно хранить при температуре 4 ° С и оставаться функциональным по крайней мере 6 месяцев.

3. Человек изоляции CTL

1. Сбор ~ 100 мл свежего периферической крови здоровых HLA-A2 положительного донора на 10 BD натрия труб Гепарин Vacutainer. Использование 21-иглы или больше, чтобы предотвратить гемолиз.
2. Центрифуга на 300xg в течение 10 минут при комнатной температуре
3. Осторожно снимите верхний слой плазмы аспирации. Плазма может быть использована в качестве дополнения для культуральной среды.
4. Замените собранные плазмы стерильной PBS и передачи кровь в стерильные колбы T75 культуры или 50 мл конические пробирки. Смешать кровь с PBS также с помощью пипетки вверх и вниз.
5. После того как все кровь собирают, готовят четыре дополнительных 50 мл конические пробирки и добавить 15 мл Ficoll-Paque Plus.
6. Медленно наложения 30-35мл клеток крови в верхней части Ficoll каждой трубы. Держите интерфейс между различными Ficoll и клетки крови.
7. Центрифуга на 500xg в течение 20 минут при комнатной температуре. Включите тормоз "выключено" и ускорение как можно ниже, чтобы сохранить ясный интерфейс между слоями.
8. Использование seriological пипетки, тщательно аспирата РВМС слой и собирать РВМС в свежем 50 мл коническую трубку. Когда все РВМС собирают добавить 30 мл PBS и спина на 400xg течение 10 мин. Удалите супернатант и промыть еще раз с 30 мл PBS для удаления остатков Ficoll.
9. Приступить к CD8 ⁺ Т-клеток изоляции с помощью Miltenyi человека CD8 ⁺ Т-клеток изоляции комплект в соответствии с протоколом производителя. Этот набор очень обогащает для CD8 ^{+ клеток} (обычно> 95%) за счет истощения CD8 ^- клеток.
10. Граф CD8 ⁺ Т-клеток. Ожидается чистота должна быть больше 95%. Для подтверждения этого использовать 2х10 ^{5 клеток} и выполняют CD4/3/8 FACS анализ. Остальные CTL может быть использован сразу для антиген-специфической AAPC стимуляции или они могут быть заморожены для дальнейшего использования.

4. В пробирке AAPC система культуры

1. Подготовка питательной среды
   1. Для TF (Т-клеточный фактор роста, сделанный в лаборатории ⁴⁾ 2X культуральной среде: полной среде RPMI плюс 5% доноров аутологичной плазмы и 8% Т-клеток фактор роста.
   2. Донора аутологичной плазмы может быть заменен тепла инактивированной человеческой АВ сыворотки.
2. Ресуспендируют 1 млн CTL в 8 мл ТФ 2X культуральной среде плюс 8 мл полной среды RPMI, добавить 1 × 10 ⁶ AAPC, хорошо перемешать.
3. Использование многоканальных pipetter к пластине клеток на 96-U нижней пластины тканевой культуры. (160 мкл на лунку)
4. Культуры клеток в 37 ° С, 5% СО ₂ incubater течение 7 дней. Поток клеток на 4-й день с 80 мкл / лунку средой TF 2X.
5. Клетки готовы быть собраны на 7 день. После сбора урожая, место клетки от магнита и удалить старый AAPC.
6. Антиген специфичность может быть определена путем окрашивания тетрамер в соответствии с протоколом производителя. Окрашивание Фенотип и внутриклеточных цитокинов окрашивание производится в соответствии с нашими предыдущими ³ исследования.
7. Собранные клетки могут быть replated с AAPC снова на тех же условиях. Число клеток и антигенной специфичности, как ожидается, увеличится после повторной стимуляции.

5. Представитель Результаты:

Примером AAPC после конъюгации HLA A2-Ig и анти-CD28 показано на рисунке 4. Успешное сопряжения белок очевидным явный сдвиг соответствующих меченых антител. В то время как частота ЦМВ конкретных CTL в периферической крови, как правило, 0,5-1%, после одной недели AAPC-опосредованной стимуляции, специфичность может достигать 55 - 93% (рис. 2 и 3). Расширение антиген специфический CTL могут быть самыми разными между различными донорами, но результаты воспроизводимы в пределах того же донора. По экстраполяции, расширения ЦМВ специфические клетки могут быть тысячи раз по сравнению с предшественником уровней непосредственно бывших естественных условиях (данные не приведены). Внутриклеточного окрашивания цитокинов (рис. 3) показывает, что эти расширенные CTL являются полифункциональные, а не исчерпан, после длительных клеточных культур и значительного распространения.

Рисунок 1. Представителю блок-схема AAPC основан расширения естественных ех человек CTL для приемных иммунотерапии в аллогенных ГСК

Рисунок 2. Представителю тетрамер окрашивания результат ЦМВ конкретных CTL порожденных AAPC после одной недели культуры

Рисунок 3. Представителю внутриклеточных результат окрашивания цитокинов ЦМВ конкретных CTL порожденных AAPC (специфичность ЦМВ был 61%)

Рисунок 4. Представителю результат окрашивания М-450 бусин эпоксидной после белка сопряжения окрашенных анти-мышиные IgG1-PE и анти-мышь IgG2-FITC

Обсуждение

AAPC система, которую мы описываем здесь является эффективной системой для бывших расширения естественных условиях на человека CTL против различных антигенов. Особое внимание должно быть принято в отношении качества белка сопряжения и равномерное распределение AAPC и CTL в 96-луночного планшета для культуры. Используя этот подход, мы смогли расширить CTL более 8 недель, в течение которых мы расширили антиген-специфические CTL до миллиона раз ^4. Там были различные искусственные системы APC использованием клеточных линий или других бесклеточных платформы ^5, однако, согласно опубликованным данным каждая система имеет свой ​​уникальный профиль в отношении расширения и специфичность поддержки различных приложений. Важно отметить, что, так как качество CTL также важно, как количество, полифункциональность ЦМВ-специфический CTL порожденные нашей системы, как ожидается, предоставляют превосходные антивирусные эффективности.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент	Компания	Номер в каталоге
Vacutainer трубки (содержит гепарин)	Becton Dickinson	367874
Человек CD8 + Т-клеток изоляции комплект	Miltenyi	130-094-156
Dynabeads М-450 Эпоксидная	Invitrogen	140,11
Dynal MPC-1 Магнит	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI среда 1640	Гибко	11875
HLA-A2-Ig димера X	Becton Dickinson	551263
iTAgMHC тетрамер (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter	T20099
Сокол ясный 96-луночного Микротест пластины	Becton Dickinson	353077
Крыса анти-мышиных IgG2a-FITC	Becton Dickinson	553390
Антимышиного IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Человеческого сывороточного типа AB	Атланты биологических препаратов	S40110
Мышь анти-человеческий CD8a-FITC	Sigma-Aldrich	F0772
Мышь анти-человеческий CD8a АПК	Becton Dickinson	340684
Мышь анти-человеческий IFNγ-FITC	Becton Dickinson	340449
Мышь анти-человеческий ФНО-PE	Becton Dickinson	340512