Анализ локальных Обработка сети с помощью Multi-контакт Ламинарный электрода Запись

Резюме

Фундаментальный вопрос в нашем понимании коркового схемотехника, как сети в разных слоях коры кодирования сенсорной информации. Здесь мы описываем электрофизиологические методы использования мульти-контактные электроды ламинарного к записи одной единицы и местных потенциалов области и настоящим анализы для выявления слоях коры.

Аннотация

Корковых слоях повсеместно структуры всей коры головного мозга ^1-4, которые состоят из высоко периодически локальных сетей. В последние годы значительный прогресс был достигнут в нашем понимании различий в ответ свойств нейронов в различных слоях коры ^5-8, тем не менее еще ​​многое осталось узнать о ли и как нейронные популяции кодирования информации в ламинарном конкретных образом.

Существующие многоэлектродной методы массивов, хотя информативным для измерения ответы во многих миллиметров корковых пространстве вдоль поверхности коры, не способны подходить к проблеме ламинарного корковых схем. Здесь мы представляем наш метод для создания и записи отдельных нейронов и местных потенциалов поля (LFPs) через коркового слоя первичной зрительной коре (V1) с использованием мульти-контакт ламинарного электроды (рис. 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc).

Методы включены записывающее устройство строительства, определение коркового слоя, а также определение рецептивных полей отдельных нейронов. Чтобы определить коркового слоя, мы измеряем вызвала отклик потенциалов (ССП) из LFP временных рядов с использованием полного поля мелькнула раздражители. Мы затем выполнить источника тока плотности (КУР) анализ, чтобы определить инверсии полярности сопровождается раковина источника конфигурации на базе слоя 4 (раковина находится внутри слоя 4, впоследствии называемый зернистого слоя ^9-12). Текущий источник плотности является полезной, поскольку она обеспечивает индекс местоположение, направление и плотность трансмембранного тока, что позволяет нам точно положение электродов для записи из всех слоев в одном проникновения ^{6, 11, 12.}

протокол

1. NAN Microdrive строительства

Мы используем U-зонда в комбинации с системой привода электрода NAN. Строительство этой системы требуется 2-3 часов, но когда-то построил это очень просто изменить. Мы начинаем сборку НАН башню, которая включает в себя 4-канальный основания (рис. 2а), NAN камеры (рис. 2б), сетки с 1 мм шагом (рис. 2), 1-4 винт микродиски (Рис. 2d), 1 -4 труб руководство (рис. 2е, 500 мкм в диаметре и сократить примерно до 5-7 см), и 1-4 Microdrive башни (рис. 2е). Для простоты мы будем описывать процедуру для построения системы NAN с одной башни и один U-Probe. После некоторой тренировки, эта процедура обычно занимает 2-3 часов, если все материалы доступны.

1. Для построения диск НАН электродный узел, первая сборка измерить все инструменты и куски вам нужно (например, трубы руководства, проводник, полный комплект dremil, NAN инструменты и их части и U-зонд). Мера направляющих труб так при подключении к устройству записи они достаточно долго, чтобы почивать на вершине оболочки, не повреждая ее.
2. Для построения диск НАН электродного узла, первой мерой глубины записи камеры. Затем вырезать направляющих труб с измеряемой длиной около 5-7 см. При резке направляющих труб, необходимо обеспечить, чтобы никакие металлические фрагменты войти внутрь трубки. Использование жесткой проволоки меньше, чем внутренний диаметр направляющей трубы для удаления металлических фрагментов внутри трубки.
3. Далее, поместите сетку NAN на базе НАН. Затяните винт зажима и сетки винта. Как только база и сетки закреплены, идентифицировать запись интересующей области и заранее направляющую трубу по дну сетки NAN.
4. Pass направляющую трубу через сетку, пока она составляет около 1-2 мм вне камеры NAN. Как только направляющая трубка находится в нужное положение, начать сборку НАН Microdrive башни.
5. На каждой башне НАН Microdrive Есть два зажима - двигатель приводит верхней зажим, в то время как нижний зажим может быть как фиксированной на месте или плохо. Прикрепите верхний зажим для укрепления трубки U-Probe. Прикрепите нижний зажим для направляющей трубки и нанесите небольшое количество суперклея для обеспечения направляющая трубка на месте. Эта система является более стабильной и более точным в связи с двумя зажимами, которые прикреплены к укреплению трубки U-Probe.
6. Тщательно выровняйте кончик U-зонд с верхней направляющей трубки и передать U-зонда через направляющую трубку, пока вы можете защитить башню до основания НАН. Отрегулируйте положение башни с винт так, что не существует добавил напряженности на U-Probe или направляющей трубки.

2. U-Probe стерилизации

Электрод ламинарный или Plextrode U-Probe закупается у Plexon Инк и доступна по цене около $ 2000 - $ 4000. Цена зависит от трех основных аспектах: количество контактных участков, конфигурация сайтов, а диаметр каждого сайта. Мы в настоящее время используется 16-канальная версия с линейной конфигурацией и контакта диаметром 25 мкм. Важно отметить, что толщина U-зонда непосредственно связана с контакт диаметра. В наших экспериментах мы всегда использовали 25 мкм в диаметре контактов, которая равна 360 мкм толщиной. Текущей стоимости для наших версии модели составляет около $ 3500 долларов. U-Probe поставляется упакованной в случае электродов с помощью перемычек и заземления проводов и свинцово-времени от покупки до доставки составляет около 4-6 недель.

1. Место системы NAN от основания цилиндра и подключить кабели двигателя в соответствующие башни. При использовании нескольких башнях цветных связей почтовый используются, чтобы помочь различать кабели двигателя и башни.
2. Использование программы НАН программного обеспечения, начинают продвижение U-Probe, либо установить целевые позиции, которая автоматически достижений U-Probe в эту папку или нажмите на ссылку "Вниз" на программный интерфейс NAN. Advance U-зонда, так что как минимум 10 мм наконечник через направляющую трубу прошлого конце камеры NAN.
3. Для стерилизации U-Probe, место в MetriCide решение Активированный диальдегида в течение 20-30 минут до крепления основания НАН чтобы имплантированные записи камеры. После этого промойте U-Probe и НАН базы стерильной водой.
4. Нулевой местах НАН программного обеспечения втягивания U-Probe, чтобы кончик прямо внутри направляющей трубки. В программное обеспечение NAN, нажмите нулю все позиции.
5. Прикрепите к базе НАН имплантированных записи камеры и затяните все четыре винта. Затем выровняйте базы в соответствии с булавку, которая находится на стороне записи камеры. Затяните все четыре винта и убедитесь, что базы НАН надежно прикреплена к записи камеры.

3. Продвижение U-зонд для записи

Учитывая, что прочность и толщина оболочки сильно варьирует между субъектами, мы внедрили общий порядок для продвижения U-Proиспользовать системы НАН Microdrive. Важно отметить, что каждое U-Probe поставляется с подробным анализом каждого контактов сопротивление и общий рейнджер для U-Probe. Мы использовали электроды, чьи контакты сопротивления составляла от 0,3-0,5 МОм. В настоящее время существует сопротивление тестера можно приобрести в Plexon но, к сожалению, во время нашей записи этого устройства не доступны. В результате, мы были не в состоянии выполнять детальный анализ импеданса.

1. U-Probe остается плавающим (имеет один провод подключенных перемычку на разъемы в нижней части). Headstages крепятся к U-Probe разъем и усилитель подключения кабелей и заземлены.
2. Начальное продвижение около 1-2 мм должен быть быстрым и сильным. Установите параметр скорости в диапазоне 0,1 - 0,2 мм / сек и глубиной шага до 0,2 - 0,3 мм. Эти значения будет гарантировать, что U-зонд способен прокол оболочки чисто и является важным первым шагом в записи.
3. Как только через оболочки, снижение скорости до 0,050 -0,1 мм / сек и уменьшить глубину шага до 0,05 - 0,1 мм. Цель состоит в продвижении U-Probe так гладко и медленно, как возможно такое, что ни ткань повреждена. Одним из признаков того, что зонд вошел в мозг изменение амплитуды LFP сопровождается сокращением уровня шума (наложение текста: локальный потенциал поля).
4. Чтобы убедиться, что электрод, охватывающих все слои коры, измерять изменение амплитуды в ответ на полное поле стимул белую вспышку. Изменения амплитуды LFP во времени лежат в основе анализа вызвали отклик потенциал. Этот анализ служит основой для определения слоях коры.

4. Идентификация и проверка коркового слоя

Мы внедрили процедуру выявления корковых слоев с помощью вызвала отклик потенциал (ПРП) парадигмы и источника тока плотности (КУР) анализа. Мы полагались на КУР, поскольку она обеспечивает индекс местоположение, направление и плотность трансмембранного тока, что позволяет нам точно положение электродов для записи из всех слоев в одном проникновения. В самом деле, Карл Шредер и его коллеги ранее комбинированные ламинарного записи, microlesion, и гистологических реконструкции с целью проверки эффективности ERP / CSD метод функциональной идентификации коркового слоя в V1 ^9-12. Другие методы, использующие спонтанно генерируемых колебаний были использованы для определения глубины коры, таких как корковые шпинделей и вверх / вниз государств ^13-15.

Для этого анализа, мы используем МКУР инструментов для MATLAB, который вычисляет КУР по второй пространственной производной LFP временных рядов по одинаковом расстоянии контакты U-Probe ( http://software.incf.org/ программное обеспечение / csdplotter / дома ) ^9,10,16,17.

1. Чтобы определить коркового слоя, мера вызвала отклик потенциала при пассивной задачей фиксации разоблачая при условии полного поля черный экран, который мигает белым в течение 100 мс, а затем возвращается к черному. Эта последовательность представляет собой один судебный процесс, который повторяется 200 раз.
2. Приобретение Plexon Многоканальный процессор сохраняет все непрерывные сигналы данных непосредственно в записи компьютера через борт National Instruments PCI. После того как данные сохранены, начать обработку сигналов для источника тока плотностью анализа.
3. Использование программного обеспечения коррекции FPAlign предоставляемые Plexon исправить временные задержки в LFP сигналов индуцированного фильтры в headstages и предварительного усиления плит.
4. На данный момент данные передаются в MATLAB с Neuroexplorer. Каждый канал LFP фильтруется с использованием стандартных высоких и фильтр нижних частот с частотами среза от 0,5 Гц и 100 Гц. После каждого контакта электрода был отфильтрован, идентифицировать каждого испытания и среднем по испытаний, чтобы получить средний LFP временные ряды для каждого контакта электрода. Затем организовать каждого контакта в матрицу с LFP амплитуды как функции времени.
5. Выполнить МКУР (наложение текста: источника тока плотности) в панели инструментов MATLAB, набрав CSDplotter в рабочей области. Учитывая, что частота дискретизации непрерывных данных составляет 1 кГц, установите параметр DT до 1 мс. Далее, установите значение проводимости коры до 0,4 См / м (это приблизительно равна плотности тока источника в единицах nanoamperes на кубический миллиметр) и изменить положение электрода в качестве вектора [0.1:0.1:1.6] с учетом количества контактов. Когда все параметры были вставлены нажмите "Run This".
6. Просмотр профиля КУР в CSDplotter интерфейс и вставить его в новую фигуру. Общие функции в MATLAB, такие как imagesc могут быть использованы для построения слой профиля, а также различные алгоритмы сглаживания и нормализации функции могут быть применены для представления данных CSD и сравнивая уровень идентификации через часи сессий.
7. Для определения полярности сопровождается раковина источника конфигурации на базе слой 4, во-первых, проверьте наличие первичной тонут в зернистого слоя с использованием профиля ламинарного КУР. Найдите раковина приводом отрицательной полярности в сюжете КУР. Затем вычислить центра массы гранулированного раковину.
8. Центр тяжести получается из анализа, состоящий из числа контактов и время, когда раковина была большая. Контакте с раковиной тяжести служит гранулированный опорного слоя при 0 мкм. Анализ всех контактов выше и ниже ссылки и сгруппировать их в один из трех возможных уровней: supragranular, гранулированных и infragranular.
9. Проверка гранулированных мойки, шарканье электрода позиции оставляя временной области без изменений. После перетасовки CSD матрицы, вычисление центра тяжести анализ еще раз. Перетасовка электрода контакты как функция коры глубина должна уничтожить все ламинарного специфику.

5. Идентификация отдельных нейронов и восприимчивым отображение поля

Мы имели большой успех с изолирующими и запись нескольких отдельных единиц из U-Probe. На записи обычно, мы можем рассчитывать на 6-10 хорошо изолированные единицы и 14-16 локальные сигналы потенциальном поле. Поиск отдельных единиц также является более надежной с U-Probe сравнению с одиночными электродами. Даже если бы нужно было использовать все необходимые аппаратные средства, чтобы точно заранее 16 электродов, они не были бы в состоянии исследовать сеть населения в зависимости от коркового слоя настолько точно, насколько с U-Probe. Наконец, мы обычно можем с той же U-зонда на 30-40 проникновений.

1. Чтобы найти рецептивных полей, начинайте, представляя обратный стимул корреляции на монитор, где рецептивных полей, потенциально находятся. Стимул состоит из четырех решетки ориентации на 0, 45, 90 и 135 градусов.
2. Выполните кластерного анализа стрельбы карты скорость, чтобы найти рецептивного поля. Во-первых, вычислить максимальный темп стрельбы местах и ​​их тяжести для каждого времени задержки. Затем, рассчитать расстояние между центром тяжести и этих местах максимальной скорости стрельбы. Вычислить карты стрельбы ставки на каждом пространственного положения для проведения задержки между 40 - 120 мс при 5 мс интервалы для каждого нейрона отдельно.
3. Найти общее расстояние между центром тяжести и окружающих огневых точек максимальная скорость за все время задержки. Рецептивного поля находится на временной задержкой, что сводит к минимуму этого расстояния.
4. Как только рецептивного поля находится для каждой ячейки, настоящее обратный стимул корреляции больше всех восприимчивы подразделениях на местах перекрывал все рецептивных полей в записанном населения. В режиме реального времени скорострельность участок может быть использован для определения правильного восприимчивы подразделениях на местах не выявлено.
5. И наконец, удалить отдельные подразделения, которые резко меняют свои ответы и только сохранить единицы со стабильной стрельбы ставки для дальнейшего анализа. Кроме того, выберите запись сайты с лучшими сигнал-шум.

6. Представитель Результаты: Записи одного подразделения и LFPs через корковые слои из первичной зрительной коры

Один из самых важных шагов в анализ с использованием ламинарного электродов надежно идентифицировать коркового слоя и убедиться в этом идентификация по много часов и сессий. Таким образом, мы измерили вызвала отклик потенциалов (ССП) из LFPs через ламинарный контактов в ответ на полное поле вспыхнула раздражителя (рис. 3а). Рисунок 3b представляет собой пример типа информации, необходимо получить для того, чтобы вычислить источника тока плотности (CSD) для выявления слоях коры. Затем мы использовали анализ КУР LFP временных рядов для определения полярности сопровождается раковина источника конфигурации на базе слоя 4. Рисунок 4а показывает анализ КУР в локализации коркового слоя коры по всей глубине, как функцию времени - положение supragranular (SG), зернистые (G) и infragranular (ИГ) слоев оставались стабильными даже через четыре часа после начала сессии записи. На рисунке 4б содержит CSD следы, которые представляют собой среднее значение этих контактов назначен данный слой - в этом примере, зернистый слой подвергается отчетливое снижение КУР амплитуды на ~ 50 мс. Этот анализ служит основой назначить электрода контакты выше и ниже зернистого слоя, чтобы supragranular и infragranular слоев, соответственно (контакт с крупнейшим раковину центра масс служила гранулированных опорного слоя при 0 мкм).

Другой критический анализ с использованием ламинарного электрод, чтобы точно идентифицировать и локализовать рецептивного поля нейронов. Эта процедура имеет жизненно важное значение для позиционирования стимулом для создания самой надежной ответ от нейронов. На рисунке 5а является пример двух восприимчивы участки поля нейронов в первичной зрительной кортех (V1). Происхождение этих участков фиксации точки, которая является небольшой белый круг отображается централизованно на черном экране компьютера. Цвет в этих участков представляет скорострельность каждого нейрона в ответ на стимул динамической обратной корреляции. Мы используем эту информацию для позиционирования стимулом для данного эксперимента (например, синусоидальные решетки). Стимулы, которые представлены больше, чем средний размер восприимчивой области, с тем чтобы охватить восприимчивы местах поле всех одновременно зарегистрированных нейронов.

После того как мы определить коркового слоя и положение стимула в оптимальном месте восприимчивы поле, мы можем перейти к экспериментальной протокол, в котором мы представляем различные визуальные стимулы в то время как животное выполняет либо фиксации или дискриминации задач. После эксперимента, мы выполняем наши спайк-анализ формы волны, чтобы изолировать одну-единицы, мы смогли записать тот же канал. Эта процедура часто занимает некоторое время, чтобы освоить и постоянно совершенствуется в качестве нового программного обеспечения для анализа и методики были доступны. На рисунке 5б является примером типа вывода можно было бы ожидать после использования Offline Сортировщик Plexon в. С помощью этого программного обеспечения, один изоляторе осуществляется путем визуального осмотра. Отдельное кластеров определены на основе веса первой и второй основных компонентов, шипованные ширины, долине, а пик свойствами.

Рисунок 1. Multi-контакт ламинарного электродами с использованием мульти-контактные электроды ламинарным, мы записали одновременно пики активности отдельных нейронов изолированной и LFP подразделений по всей коркового слоя V1. Каждый U-Probe состоит из 16 равноотстоящих (100 мкм) электрод контакты охватывающих общую длину 1,6 мм. Каждый электрод контакта составляет 25 мкм в диаметре и состоит из платины иридий.

Рисунок 2. NAN сетки строительства системы НАН Microdrive обеспечивает дополнительную стабильность и точность над классическими винт управляемых Microdrive. Каждая группа электродов независимо манипулировать в плоскостях XY, в пределах определенной пользователем рабочего диапазона. Каждая группа электродов независимо манипулировать в направлении Z в пользовательской рабочей глубине (до 100 мм) и переменную диапазоне скоростей от 0,001 мм / сек до 0,5 мм / сек и с высоким разрешением в 1 микрометр () 4. - канала базы, (б) НАН камеры, (в) сетки с 1 мм шагом, (г) 1-4 микродиски винт, (д) 1-4 труб руководство (500 мкм в диаметре и сократить примерно до 5-7 см) , (е) 1-4 башни Microdrive и (г) завершила НАН системы и основания цилиндра.

Рисунок 3. Вызванные ответ потенциальные парадигмы и LFP временных рядов (а) определить коркового слоя, мы измерили вызвала отклик потенциал (ПРП) во время пассивного задача фиксации в то время как обезьяны подвергались всего месторождения черный экран, который мелькнул белый (~ 1 Гц) на 100 мс, а затем вернулся к черному. (б) LFP ответы записаны с ламинарным U-Probe были обработаны для получения ERP следы для каждого контакта. Зернистого слоя была определена во всех сессиях, за счет размещения раковины управляемой инверсии в амплитуду реакции в следы ERP, а также наличием инверсии полярности сопровождается раковина источника конфигурации на базе слоя 4. Пунктирную рамку указывает сроки период времени, когда инверсия произошла.

Рисунок 4. Слой Идентификация использованием источника тока плотностью анализа () источника тока плотностью анализ (на базе ^2-й пространственной производной LFP временных рядов) была использована для определения полярности сопровождается раковина источника конфигурации на базе зернистого слоя. Мы оценили как стабильное определение коркового слоя сохраняется в течение долгого времени (слева направо). В этих примерах текущего приемника (синий) представляет зернистого слоя и охватывает около 400 мкм. (Б) CSD следы ниже каждого участка представляют средний CSD этих контактов назначен данного слоя. Это позволило нам определить точное время начальной раковиной (в этих примерах ~ 50-60 мс. CSD следа конверты представляют стандартное отклонение и черные полоски указывают на длительность стимула мелькнула (100 мс).

Рисунок 5. Спайк сортировки и восприимчивым отображение поля () Во-первых, половина визуальные степени рассчитывается и два раза. Затем, обратная корреляция стимулы представлены в пятна на ЭЛТ-монитор сonsisting ориентированных решетки на 0, 45, 90 и 135 градусов. Стрельба ставки для каждого нейрона рассчитывается независимо друг от друга на 5 интервалов мс от 40 до 120 мс после стимула представлена ​​для каждого пространственного расположения. Максимальная стрельбы ставки рассчитываются, а затем центр тяжести для каждого времени задержки. Тогда в каждой задержке расстояние между центром тяжести и прилегающих стрельбы местах ставка рассчитывается. Временная задержка с минимального расстояния выбрана в качестве рецептивного поля. (Б) Спайк сигнала свойства, такие как высота пика, долину глубиной, пик времени долине, время пика или долины, и т.д. анализируются с помощью программного обеспечения форума сортировки ( Plexon). Шипы сортируются на основе аналогичных свойств, пока сигналы от одного нейрона сгруппированы без перекрытия от другого.

Рисунок 6. Перетасовываются CSD профиля. Той же Конвенции, как на рис 3а, но мы провели перетасовки процедура, которая в случайном порядке новые CSD матрица с места контакта смешанные. Этот анализ используется для проверки лучше гранулированного мойки, шарканье электрода позиции оставляя временной области без изменений. Из этих примеров отображается в течение долгого времени, тасуя электрода контакты как функция коры глубиной уничтожает любую ламинарного специфику.

Обсуждение

Multi-единицы записи стали стандартом для анализа того, как нейронные сети в коре кодирования стимул информации. Учитывая последние достижения в области электрода технологии, реализация ламинарного электродов обеспечивает беспрецедентный характеристику местных корковых схем. Хотя мн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Наименование оборудования	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Нан Microdrive системы	Нан инструменты	Нан-S4	Рисунок 2. Custom зажимы, необходимые для использования U-Probe. Все сказанное, за исключением U-Probe обеспечивается инструментами NAN.
Винт микродиски	MIT Механический цех		Все, что в состоянии обеспечить направляющей трубки к сети НАН должна быть соответствующей.
Нержавеющая сталь направляющих труб	Мелкие детали	B00137QHNS (1) или B00137QHO2 (5)	Это 60 в долгой и нарезанные по размеру в лаборатории с помощью Dremel ручная дрель
Plexon U-Probe	Plexon, Inc	PLX-UP-16-25ED-100-SE-360-25Т-500	Смотрите U-Probe спецификации доступны на www.plexon.com Также см. Рисунок 1.

Название программы	Компания	Веб-сайт	Комментарии
NAN программного обеспечения	NAN	http://www.naninstruments.com/DesignConcept.htm	Компьютерный интерфейс требует дополнительных последовательных порта для размещения системы Plexon и аппаратных NAN
Offline Сортировщик, FPAlign, PlexUtil, MATLAB программ	Plexon	http://www.plexon.com/downloads.html # Программное обеспечение	В разделе "Установка пакетов"
NeuroExplorer	NeuroExplorer	http://www.neuroexplorer.com/	В разделе "Ресурсы"
CSDplotter Версия 0.1.1	Клас H. Петтерсон	http://arken.umb.no/ ~ klaspe / user_guide.pdf