Экс Vivo Заражение живой ткани с онколитических Вирусы

Резюме

Онколитических вирусы являются перспективными для рака терапии. Возможность установить infectability живых образцов ткани, полученных от пациентов до начала лечения является уникальным преимуществом этого терапевтического подхода. Этот протокол описывает процесс тканей для Исключая виво Инфицирование вирусом онколитических и последующее вирусное количественной оценке.

Аннотация

Онколитических Вирусы (ОВС), являются новыми терапии, избирательно копировать и убить опухолевые клетки ^1. Несколько клинических исследований, оценивающих эффективность различных платформ, включая онколитических HSV, реовирус и Vaccinia OVS для лечения рака В настоящее время проводятся ^2-5. Один из ключевых характеристик онколитических вирусов является то, что они могут быть генетически модифицированными, чтобы выразить репортер трансгенов что позволяет визуализировать инфекции тканей с помощью микроскопа или био-люминесцентные изображения ^6,7. Это обеспечивает уникальное преимущество, так как возможно заражение тканей из естественных бывшие пациенты до начала лечения, чтобы установить вероятность успешного онколитических virotherapy ^8. Для этого крайне важно надлежащим образец ткани для компенсации неоднородности ткани и оценить жизнеспособность тканей, особенно перед инфекцией ^9. Важно также следить вирусной репликации с использованием репортер трансгенов, если выраженное онколитических платформы, а также прямое титрование тканей следующие гомогенизации для того, чтобы различать неудачной и продуктивной инфекции. Цель этого протокола для решения этих проблем и в этом описывает 1. Отбора проб и подготовки ткани опухоли для культуры клеток 2. Оценка жизнеспособности тканей использованием метаболических красителя Аламар синий 3. Ex инфекции естественных условиях культурного тканей вируса коровьей оспы выражения либо GFP или люциферазы светляков 4. Обнаружение экспрессии трансгена путем флуоресцентной микроскопии или с использованием В Vivo изображений (ИВИС) 5. Количественная оценка вирусом налетом анализа. Этот комплексный метод представляет несколько преимуществ, включая простоту обработки ткани, ткани для компенсации неоднородности, контроль жизнеспособности тканей и дискриминации между неудачной инфекции и кости ФИДЕ репликации вируса.

протокол

1. Ткань обработки

1. Для достижения наилучших результатов, этот протокол должен быть проведен с использованием свежевыделенных ткани на хранение в DMEM среде, содержащей 10% FBS, 1% Pennicilin / Стрептомицин решение, и 0,1% Amphothericin Б решение сразу после операции до обработки. Если это невозможно, тканей можно оставить на ночь в этой среде при температуре 4 градуса до обработки.
2. Перед переработкой образца, стерилизовать металла пинцетом и одноразовые лезвия путем сдачи их в 70% растворе этанола в течение минимум 5 минут. Также приготовьте 24-луночного планшета с 2 мл DMEM среде, содержащей 10% FBS, 1% Pennicilin / Стрептомицин решение, и 0,1% Amphothericin B.
3. Соберите образец ткани в клетку ламинарного течения культуры капот использованием стерилизованные щипцы и депозитных ткани в пустую 15 см блюдо Петри, держа крышку на стороне, стерильной стороной вверх.
4. В капотом культуре клеток, используйте 2 мм биопсии удар, чтобы получить различные ядра из различных регионов внутри ткани, как на рисунке 1. Депозит ядер в крышке 15 см Петри с помощью щипцов, оставляя достаточно места между ними каждое ядро, так что их можно легко разрезать вдоль горизонтальной оси.
5. Сплит каждого ядра на 4 даже четверти использованием стерилизованных лезвие бритвы, как на рисунке 1.
6. С помощью пипетки наконечник, положите каждое ядро ​​четверть из данного ядра в различных хорошо от А1 до А4, как на рисунке 1, уже содержащий 1,5 мл DMEM, содержащей 10% FBS, 1% Pennicilin / Стрептомицин решение, и 0,1% Amphothericin Б решение . Повторите эти действия для каждого ядра. Это должно позволить репрезентативной выборки опухоли, при минимизации погрешности в данной скважине / состояние. Для лучшего представления, увеличение количества ядер.

2. Оценка жизнеспособности тканей

1. После обработки ткани, добавить 25 мкл Аламар синий в лунку № A1 и A2 #, как показано на рисунке 1 и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 градусов в увлажненном инкубаторе с 5% CO _2.
2. После инкубации с Аламар синий, удалить 3 раза по 100 мкл друг от A1 и A2 также и трансфер в 6 различных лунки 96-луночного планшета. Прочитано сигнала с помощью флуоресценции читателя пластины (530 возбуждения, 590 выбросов) и сохранить данные в своем архиве.
3. После Аламар синий сигнал был читать, переводить все куски ткани с помощью пипетки наконечник, из хорошо А1 до С1, содержащей DMEM, 10% ЭТС + PS + AmphoB. Будьте осторожны, не передавать чрезмерное количество средств массовой информации из хорошо A1.
4. Infect скважин A3 и A4 соответственно 10 ⁶ БОЕ из GFP-выражения и люциферазы, экспрессирующих вирус коровьей оспы разводят в 25 мкл СМИ. Ну A2 может быть заражен вирусом, который выражает, что любой трансгенов в том числе ни одного.
5. 72 часов спустя, добавить 25 мкл Аламар синего к скважинам С1 и D1 и повторите шаг 2,2

3. Визуализация выражения GFP трансгенов на цветение микроскопии

1. Удалите все культуры клеток в ткани покрытия части, чтобы делать хорошие фотографии флуоресценции.
2. Использование флуоресценции с поддержкой рассечение микроскоп, сначала взять изображение фазового контраста в соответствующей резолюции
3. Переключение в режим флуоресценции и принимать изображения с помощью соответствующего фильтра для визуализации трансгенов интерес, в данном случае GFP.
4. Использование флуоресценции фильтр для другой длины волны, насколько возможно от этого трансгена интерес (например, RFP), чтобы сделать снимок на фоне флуоресценции

4. Визуализация люциферазы выражение, используя в Vivo изображений (ИВИС)

1. Убедитесь, что ИВИС инициализируется перед началом работы.
2. В скважинах A4 и B4, добавить 5 мкл люциферин подложки 10 мг / мл, тщательно перемешать и выдержать в течение 5 минут при комнатной температуре.
3. Установите время ИВИС воздействия на 5 секунд и сфотографировать ваш скважин. Если изображение имеет насыщенный, повторить с меньшим временем экспозиции. Если нет сигнала, увеличения времени экспозиции.
4. Использование программного обеспечения ИВИС изображений, вы можете удалить фоновом режиме, используя сигнал с хорошо B4 и выберите регион представляет интерес для количественной оценки сигнала люминесценции.

5. Оценка вирусные титры бляшкой анализа

1. До количественной вирусные титры, ткани должны быть сначала гомогенизированный выпустить вирусных частиц. Это может быть сделано через несколько месяцев в зараженных образцов тканей хранятся при температуре -80
2. Взвесьте образец, который необходимо гомогенизированный использованием аналитических масштабе. В этом случае, мы будем использовать образец, собранный из хорошо А2.
3. Место ткани в 5 мл полистирола с круглым дном трубки сокола и добавьте 1 мл PBS. Однородный ткани с использованием ткани гомогенизатора. При необходимости, хранить при -80 гомогената для оценки вирусные титры на более позднее время.
4. Для титр вируса коровьей оспы, в первую пластину 1 млн U2OS клеток в 6-луночного планшета и инкубировать в течение ночи в 37 градусов, 5% СО ₂ влажныхified инкубатор такой, что они достигли примерно 95% слияния следующий день.
5. Используйте сыворотку свободных средств массовой информации, чтобы делать серийные разведения вируса, убедившись, что изменение советы от каждого разведения шаг. Обычно мы делаем 1 из 10 разведения и использования 100 мкл передать в 900 мкл. Сколько разведения делаются в зависимости от ожидаемого выхода вируса.
6. После принятия разведения, удалите СМИ, освещающих покрытые клетками U20S затем добавить 500 мкл разведенной фондовом вирус (для каждого разведения), чтобы заразить U2OS клеток. Инкубируйте клетки в течение 1 мин час при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO ₂ увлажненный инкубатора.
7. За это время разогреть 2 X сосредоточены DMEM, содержащей 20% FBS и 3% CMC решение в 37 градусов водяной бане.
8. После 1 часа инкубации удалить СМИ, освещающих инфицированных клеток U2OS. Mix 1:01 объемов 3% CMC: 2X DMEM, 20% ЭТС вместе и использовать 2 мл этой смеси, чтобы покрыть каждую лунку инфицированных клеток U2OS.
9. Положите клетки обратно в 37 градусов 5% СО ₂ инкубатора для увлажненных еще 48 часов.
10. Через 48 часов, добавьте 2 мл метанола, уксусной кислоты на фиксатор верхней части CMC наложения в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут в капот культуре клеток.
11. Отмена фиксированных наложения и вымыть остатки прочь скважин с использованием водопроводной воды.
12. Пятно фиксированные клетки U2OS с 2 мл раствора Кумасси синим на лунку и инкубировать 30 минут при комнатной температуре на низкой скорости на тарелку шейкер.
13. Удалить пятно от Кумасси скважин и вымыть пластины с использованием водопроводной воды. Дайте высохнуть с крышку примерно на час.
14. Результат вирусной бляшки могут быть легко визуализированы на рис 2С. Плиты могут храниться бесконечно на данном этапе.
15. Граф бляшек при разведении шаг, где от 10 до 100 бляшки видны.
16. Умножьте количество бляшек путем разбавления использовать и умножить полученное число на 2 для получения титра в БОЕ / мл. Например, если 25 бляшек учитываются в колодец, где миллион раз разведения был использован, титр начальной неразбавленного образца 25 умноженное на 1 миллион умножается на 2 или 50 миллионов БОЕ / мл. Далее разделить это число на вес первоначально мера для образца к докладу титры в БОЕ / г

6. Представитель Результаты:

Для того, чтобы точно определить, является ли хирургическим путем получены нормальные / опухолевой ткани образца или не быть заражены вирусом, нужно сначала убедиться, что образец ткани, по крайней мере жизнеспособна. Рис 1А показывает, что жизнеспособность можно оценить, используя метаболические красителя (Аламар синий), и что обе нормальной и опухолевой ткани может остаться метаболически активных в течение по крайней мере 72 часа. Это говорит о том, что ткани культурный естественных бывшие может поддерживать репликацию вируса. Существенным преимуществом онколитических вирусов является то, что они могут быть спроектированы, чтобы выразить терапевтических или изображений трансгены. Рис 2D-E показывает, что GFP или люциферазы могут быть обнаружены в тканях инфицированных бывших естественных условиях, дальнейшей поддержки, что эти ткани жизнеспособной, а также заражены. Хотя возросший экспрессии трансгена, как правило, связан с вирусной репликации, это не обязательно означает продуктивной жизненного цикла вируса, что приводит к самостоятельной усиления и распространения, который считается важным для терапевтической активности. По этой причине, необходимо определить, является ли вирус больше производится, чем было использовано для первоначального заражения тканей. Рис 2B показывает, что при вирусной количественного анализа бляшкой, больше вируса, полученные после 72 часов, то инфекция тканей собраны сразу же после заражения. В целом, эти данные показывают, что хирургическим путем вырезали опухоль ткани могут оставаться жизнеспособными в культуре клеток в течение не менее 72 часов, за это время репликации вируса могут быть поддержаны.

Рисунок 1. Обзор отбор проб ткани / секционирования протокола. Ткани образец обрабатывают путем удаления нескольких ядер 2 мм, которые впоследствии разделились на четыре квартала, которые случайным образом распределены в лунки А1-А4. Цветовые коды указывают на реагенты, используемые в каждую лунку. Серо-затененных квадратов внутри скважины представляют каждый квартал из 6 отдельных ядер изображены. Ткань в хорошо A1 передается новой скважины (С1) со средствами массовой информации после первого чтения Аламар синий. Во втором чтении будет сделано в конце 72 часа инкубации с вирусами. Уэллс A4 и B4 дополняются люциферин после 72 часов инкубации после заражения

Рисунок 2. Жизнеспособность и infectability пациентов образцов тканей. ) Тканей жизнеспособность в качестве измеряется Аламар синего сигнала на 2 часа и 72 часов после сбора. Y-ось представляет пустым исправлено Аламар синий сигнал. B) титр вируса коровьей оспысобранных на грамм ткани образцы 2 и 72 часа после заражения. C) Пример бляшек вирус коровьей оспы на U2OS клеток после окрашивания Кумасси. D) Люминесценция сигнала, полученного от пациента ВВ-люциферазы-инфицированных тканей отображаемого использованием ИВИС. E) Флуоресценция фотографии микроскопии пациента образец ткани инфицированных ВВ-GFP.

Обсуждение

Одним из важнейших шагов в этом протоколе является получение свежих образцов ткани. Если образец помещается в культуре клеток после долгого ожидания в операционной в неуместным СМИ (например, PBS), это может поставить под угрозу жизнеспособности тканей и предотвратить infectability. Следует отметить, что нормальная ткань по своей сути более склонны к этим последствиям, чем опухолевой ткани. Другая критическая точка, сколько ядер используются для образцов ткани и последовательность их размер. Несоответствия в размере приведет к изменчивости через образцов пациентов с такими факторами, как гипоксия тканей и infectectable поверхность будет колебаться в зависимости от размера ядра и основных помещений. Хотя это может быть частично решена с помощью ткани ломтерезки, одним из преимуществ метода, изложенного в том, что он сравнительно легко, менее склонны к загрязнению, и широко применимы к различным типам тканей, в том числе мягких и вязких тканей, которые не так легко поддаются для нарезки тканей. Примечательно, что количество ядер может быть увеличена, чтобы получить лучшее представление ткани. Кроме того, ядра можно разрезать на несколько единиц (например, 5-8) для размещения других потенциальных анализы делать параллельно, такие как ДНК, РНК или белка добычи. Тем не менее, количество мест, в которых ядра могут быть сокращены, чтобы воспроизводимые размеры будут зависеть от фактического размера ядер, которые можно изменить с помощью различных размеров corers. По желанию, одним из способов, чтобы помочь получить воспроизводимо части размера ткани, чтобы выровнять длину ядер с помощью линейки до дальнейшего разделения их на более мелкие куски. Протокол естественно будут изменены для обеспечения других вирусов, и мы обнаружили, что ткани могут быть жизнеспособными и поддержки репликации на срок до 6 дней. Протокол может быть продлен до измерения других вирусно-выразил трансгенов в том числе cytrokines. После инфекции, ткани также может быть встроен в парафин для дальнейшего секционирования и окрашивания иммуногистохимических методов, что позволяет для дальнейшего уточнения ткани гистологии и как она связана с вирусной инфекцией ^10-12.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Высокая глюкоза DMEM	Hyclone	SH30243.01
Эмбриональной телячьей сыворотки	NorthBio ООО	NBSF-701
Amphothericin Б решение	Sigma Aldrich	A2942	Используйте на 0,1%
Pennicilin-Стрептомицин	Sigma Aldrich	P4333	Используйте на 1%
Аламар Синий	Invitrogen	DAL1025
D-люциферин калийной соли	Молекулярные продукты изображений	D-люциферин калиевой соли 1 г	Ресуспендируют в PBS в дозе 10 мг / мл и фильтр на 0,22 мкм фильтре
MEM порошок	Гибко	# 41500018	Убедитесь в половине предложенный объем, чтобы 2X MEM и фильтр на 0,22 мкм фильтр перед использованием
Карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ)	Sigma Aldrich	C9481	Сделайте 3% раствор в деионизированной воды и автоклав. Обратите внимание, что порошок может занять некоторое время для ресуспендирования
Кумасси Brilliant Blue R	Sigma Aldrich	B7920
2 мм биопсии удар	Miltex	MX-33-31
Двойные лезвия Prep Пограничный	Personna медицинской помощи	74-0002
Флуоресцентный микроскоп disection	Leica	Модель M205 FA
В естественных изображений системы (ИВИС)	Суппорт наук о жизни	ИВИС ® серии 200
Ткань Tearor	БИОСПЕК продуктов	модель 985370-395