Единый Drosophila Омматидия Препарирование и обработка изображений

Резюме

Ограничивающим фактором в использовании взрослых Drosophila Глаза на исследование нейродегенерации и клеточной биологии трудно визуализации внутриклеточных процессов. Мы описываем вскрытия одного омматидии генерировать добросовестных первичной культуры клеток нейронов, которые могут быть предметом лечения наркозависимости и Advanced Imaging.

Аннотация

Плодовой мушки дрозофилы сделал неоценимый вклад в неврологии исследования и широко используется в качестве образца для нейродегенеративных заболеваний из-за своей мощной генетике ^1. Летать глаз, в частности, была органом выбор для нейродегенерации исследования, являясь самым доступным и жизни необязательной частью дрозофилы нервной системы. Однако основные предостережение интактных глаз трудности, из-за интенсивной флуоресценции от пигмента, в визуализации внутриклеточных событий, таких как аутофагии динамики ^2, которые имеют огромное значение для понимания нейродегенерации.

Недавно мы использовали вскрытие и культура одного омматидии ^3, что имеет огромное значение для нашего понимания autophagic нарушений в летают модель Dentatorubro-Pallidoluysian Атрофия (DRPLA) ^{3, 4.}

Теперь отчет с подробным описанием этого метода (рис. 1), адаптированных с электрофизиологических исследований ^5, который, скорее всего, значительного расширения возможности летать модели нейродегенерации. Этот метод может быть адаптирован к изображению живой субклеточных событий и следить за эффективным приемом препаратов на клетки фоторецепторов (рис. 2). При использовании в сочетании с мозаикой методов ^6-8, ответы генетически различных клеток может быть проанализированы параллельно (рис. 2).

протокол

1. Препарирование сетчатки дрозофил

1. Заполните одну лунку 3-Ну стекло с фосфатным буферным раствором (PBS 1X), а затем анестезию пролетает CO _2. И мужчины и женщины могут быть использованы для этого эксперимента.
2. Как только мухи под наркозом, забрать одну лету с помощью щипцов и поместите его в блюдце с PBS.
3. Под рассекает сферу, щепотка хоботок щипцами, а затем отделить голову от тела разрыва шею, используя второй набор щипцов.
4. Холдинг лететь головы от хоботок, разрезанные на половинки по левой / правой средней линии летать голову microscissors выявить мозга.
5. Используйте кончик пипетки вырезать, чтобы забрать сетчатке, и трансфер второй скважины на 3-Ну стекло заполнено средой Шнайдер.
6. Во-первых, удаляйте большинство из головы кутикулы, а затем удалить мозг щипцами. Держите сетчатки зажатой между пластинкой и роговицы.
7. Далее, передача сетчатки на каплю (50 мкл) свежей среды Schnieder размещаются непосредственно на стекле.

2. Препарирование омматидии

1. В зависимости от конечной целью вскрытия (как немедленной визуализации или культуры) и на оптику флуоресцентного микроскопа (прямой или инвертированный), этот шаг может иметь место либо на предметное стекло или в 24-луночного планшета. Для конечной целью этого вскрытия, омматидии будет расчлененный непосредственно на стекло.
2. Возьмите любой самый спинной или нижним концом сетчатки щипцами. Использование microscissors, вырезать сетчатки пополам вдоль спины / вентральной срединной линии подвергать омматидиев в середине глаза.
3. Продолжить понять сетчатки, что роговица вниз, а пластинка вверх. Использование тонкой иглой вольфрама, отделить омматидиев от пластинки и роговицы.
4. Одноместный омматидиев и группы омматидиев будет собирать на дне колодца или слайд. Удалите все больше мусора, которые могут иметь собранные перед началом работы.

3. Лечение, окрашивания и обработки изображений

1. Для анализа аутофагии, разбавленных 1:1000 Lysotracker в раскрывающемся Шнайдер (первый разбавленным 1:10 в Шнейдера, а затем добавить 0,5 мкл до падения на слайде), перемешайте и подождите 10 секунд.
2. Удаление избыточной жидкости из слайдов, стараясь оставить омматидии позади. Это делается лучше всего с тонкой наконечником загрузке геля.
3. Добавить каплю Vectashield для покрытия омматидиев, применять покровное и печать с nailpolish.

4. Представитель Результаты:

Хорошее исполнение протокола должны оставить число единичных омматидиев и малых групп омматидиев хранится вместе фрагментами пластинки, но красиво разделены на роговице стороны. Они могут быть отображены как в этом примере наглядно Atg8: GFP и Lysotracker, показывая autophagosomes, лизосомы и autophagolysosomes (рис. 3). Метод может быть использован для живого изображения, однако в этом случае следует отметить, что аутофлюоресценция среднего Шнайдера будет трудно отличить низкой интенсивности флуоресцентных сигналов. Дополнительного выпуска является то, что пигментные гранулы, которые остаются прикрепленными к фоторецепторов интенсивно люминесцентные, особенно в красном канале. Картина светлого может потребоваться, чтобы отличить их от подлинных органелл.

Рисунок 1. Блок-схема вскрытия процедура получения одного омматидия или небольшие группы омматидиев от летают сетчатки.

Рисунок 2. Возможные вариации простой протокол здесь описывать, которые включают летать генетики старения и вверх по течению от вскрытия и окрашивание или культивирование в течение 24 часов и введения препарата ниже по течению от вскрытия.

Рисунок 3 конфокальной проверки autophagosomes и лизосом в одном омматидия расчлененный от AW; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP.:: Atg8 / + летают, выражая полиглутаминовых Atrophin мутанта и в возрасте 12 дней при температуре 29 ° C. Панель светлого (вверху справа) показывает почти нетронутыми структуры омматидия и кадров указывает сканируемой области. Красный знаки Лизосомы, зеленый autophagosomes, авто-лизосом, в результате чего в результате слияния двух органелл, появляются желтые. Стрелки указывают на двух текущих событий слияние autophagosomes и лизосомы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Одно рассечение омматидия представленные здесь коллекции позволяет более глубокой биологической ячейки информацию о процессах, как нейродегенеративные, когда моделируется в глазу дрозофилы. Фоторецепторных нейронов более доступной, чем в других нейронов и их цитоплазме особен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Портативный CO2 диспенсер	Flystuff	59-150	Вкладыши также доступны
ДЮМОН Пинцет № 5	Агар Научно	T5034
3-Ну предметное стекло	EMS	71561-01
Micro ножницы	VWR	HAMMHSB516-09
Шнайдера среднего	VWR	733-1663
LysoTracker Красной DND-99	Invitrogen	L7528
SuperFrost Слайды	VWR	631-0108
Vectashield с DAPI	Векторные Labs	H-1200
Покровные	VWR	631-1336