Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Резюме

Мы опишем метод для обработки и экран полевых собраны комаров для разнообразия вирусов Веро анализа культуры клеток. Используя эту технику, мы обнаружили 9 различных вирусов из 4 семей в таксономических комаров, собранных в Коннектикуте.

Аннотация

Комары передавать число различных вирусов, включая важных человеческих патогенов, таких как вирус Западного Нила, лихорадка денге вируса, и chickungunya вируса. Многие из этих вирусов активизировались в эндемичных диапазонов и расширена на новые территории, что требует эффективных программ надзора и контроля, чтобы реагировать на эти угрозы. Одна из стратегий для мониторинга вирусной активности включает в себя сбор большого количества комаров из эндемичных сайтов и их тестирования на вирусную инфекцию. В этой статье мы опишем, как в обращении, процесс, и экран полевых собраны комаров для инфекционного вируса от Vero анализа культуры клеток. Комары сортируются по расположению ловушку и видов, а сгруппированы в пулы содержащего ≤ 50 человек. Объединенные образцы гомогенизировали в буферном растворе с помощью миксера-мельница и водную фазу прививку на сливной Vero клеточных культурах (Clone E6). Клеточные культуры контролируются на цитопатический эффект от нескольких дней 3-7 после прививки и любые вирусы, выращенные в культуре клеток определяются соответствующие диагностические анализы. Используя такой подход, мы выделили 9 различных вирусов от комаров, собранных в Коннектикут, США, и среди них, 5 как известно, вызывают болезни человека. Три из них вирусы (вирус Западного Нила, вирус Потоси и Ла-Кроссе вируса) представляют собой новый рекорд для Северной Америки или регионе Новая Англия с 1999 года. Способность обнаруживать большое разнообразие вирусов имеет решающее значение для мониторинга, которые создали и вновь появляющихся вирусов в организме комара населения.

протокол

1. Сортировка комаров и идентификации

1. Следующие процедуры выполняются на открытом лабораторном столе в специальной уровня биобезопасности-2 (BSL-2) лаборатории персонала, обученного работать с живыми комарами. "Холодовой цепи" сохраняется на протяжении всей процедуры.
2. Обезболить жить взрослых комаров, поставив сумку комаров коллекции в морозильной камере -20 ° в течение 5 минут. Передача коллекции сумку изолированный контейнер, содержащий сухой лед. Закрыть крышкой и выставить комары углекислого газа в течение 1-3 минут, чтобы обеспечить полный нокдаун.
3. Нажмите наркозом комаров на предварительно охлажденные кастрюлю помещен на ложе из сухого льда. Отдельные отдельных самок комаров с использованием тонких щипцов и место в пластиковые стаканчики части. Накрыть крышкой и помещают чашки на льду.
4. Определить комары вида с использованием описательной ключи таксономических на основе внешней морфологии комаров при помощи стерео микроскопа рассекает (10-60X зум), установленных на электронные таблицы озноб.
5. Комбинат определены видов комаров в пулы ≤ 50 человек в 2 мл оснастки шапка флаконах, содержащих медь BB. Флаконы помечены уникальный идентификатор.
6. После выявления всех комаров, флаконы помещают в маркированные мешки и держал в холодильнике пенополистирола содержащих сухой лед.
7. Магазин комаров бассейнов в -80 ° C морозильнике до вирусом тестирования.

2. Биобезопасности соображений, чтобы изолировать вирус от комаров

1. Следующие процедуры выполняются в уровне биобезопасности-3 (BSL-3) лаборатории, сотрудники, которые готовят для работы на этом уровне сдерживания ^1. Лаборатория средств, оборудования, процедур и практики могут быть институциональными, государственных и федеральных надзора и контроля. Ищите соответствующую подготовку и утверждение, прежде чем пытаться следующие протоколы.
2. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) для каждой процедуры, такие как одноразовые халаты, перчатки, щитки, и респираторы.
3. Лечить рабочие поверхности с 70% спиртом до и после завершения процедуры.
4. Культуры клеток и потенциально инфекционного материала обрабатываются в класс II биобезопасности кабинета (BSC).
5. Mosquito бассейны гомогенизировали в смеситель-мельницу, которая находится внутри BSC.
6. Mosquito гомогенатах центрифугируют в аэрозоль-плотные микроцентрифужных. Если эта процедура не может быть выполнена в течение BSC, оператор должен использовать респиратор при работе и извлечения образцов из центрифуги.
7. Пипец и пипетки советы погрузочно-разгрузочных работ в BSC (биобезопасность кабинет) замачивают в 10% гипохлоритом перед автоклавированием. Все лабораторные отходы дезактивации в автоклаве перед удалением.

3. Подготовка клетки Веро

1. Декантировать питательных сред из одной большой колбе культуры тканей (175 см ²⁾ вырожденных клеток Веро (Clone E6) в отходы стакан, содержащий отбеливатель.
2. Вымойте клеток Веро, добавив 5 мл аликвоту PBS и вихрем над слоем клеток и по бокам колбы и обязательно тщательно покрывают все монослоя.
3. Декантировать PBS в отходы стакан.
4. Добавить 2,5 мл трипсина-EDTA и вихрем над слоем клеток, убедившись, что полностью покрывают все монослоя.
5. Инкубируйте колбы в инкубаторе в течение 5 минут при 37 ° C, 5% СО _2.
6. Осторожно встряхните колбу и водоворот, чтобы удалить клетки от нижней поверхности. Клетки должны соскальзывать легко; инкубировать дополнительные 1-5 минут, если клетки не легко соскользнуть.
7. Добавьте 5 мл Минимальная основных средствах массовой информации (MEM), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), используя серологические пипетки и пипетки вверх-вниз 10-20 раз, чтобы разбить скопления клеток.
8. Добавить еще 15 мл MEM, 5% FBS для общего объема 22,5 мл и хорошо перемешать.
9. Место 40 малых культур тканей колбы (25 см ²⁾ в вертикальном положении в двух стойках (20 колб / стойка).
10. Место стеллажей содержащие колбы внутри шкафа биобезопасности и удалить колбу кепки, шапки размещения непосредственно перед колб.
11. Внесите 4 мл MEM, 5% ЭТС в каждую колбу использованием серологических пипетки.
12. Внесите 0,5 мл приостановлено клеток в каждой колбе (~ 1:06 коэффициент разделения) Замените колбу шапки.
13. Добавьте 50 мл MEM, 5% ЭТС вернуться к первоначальному большой колбе культуре ткани, содержащей оставшиеся суспензии клеток (~ 2,5 мл) и вернуться к колбе инкубатора. Одной большой колбе культуры ткани могут быть использованы повторно до 5 проходов и затем новая колба должна быть настройки для его замены.
14. Место небольшие культуры ткани колбы в штабелях на лоток. Swirl лоток, чтобы убедиться, что средства массовой информации равномерно покрывает дно flaks.
15. Место небольшой колбы в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО ₂ и расти ночь до 80-90% вырожденная.

4. Подготовка комаров бассейнов

1. Держите комаров бассейны холода во время процедуры тестирования. Используйте предварительно охлажденноеморозильник стойки и смеситель-мельница кассеты, ледяной реагентов, и центрифуга с охлаждением при обработке комаров бассейнов.
2. Место пробирки с комарами в предварительно охлажденной морозильник стойки и добавить 1 - 1,5 мл PBS-G в каждую пробирку комаров.
3. Получить смеситель-мельница кассеты из морозильной камеры. Место 24 труб в каждой кассете, а затем в безопасности в смеситель-мельницы.
4. Однородный образцы в течение 4 минут при 25 циклов / секунду. Вибрационная мельница трясет труб с высокой скоростью и металла BB внутри каждой трубы нарушает комар ткани.
5. Пробирки центрифужные в течение 6 минут при 7000 оборотах в минуту.
6. Место трубы обратно в морозильник стойки до инокулировали в клетках Веро.

5. Заражение клеток Веро с москитной гомогенатах бассейн

1. Не реже, чем один культуре ткани колбу из каждой серии под инвертированным микроскопом для обеспечения адекватного слияния и клеточной здоровья; рассчитывать примерно на 80-90% покрытия.
2. Выстроить 20 малых культур тканей колбы в стойку и маркировать колбы с соответствующими номерами присоединения друг от комаров бассейн.
3. Ослабить шапки и переливать большинство средств массовой информации из тканевой культуры колбы в отходы стакан. Оставьте достаточно средств массовой информации в колбе, чтобы полностью монослоя ячейки пальто.
4. Алиготе 100 мкл надосадочной друг от комаров обрабатываются бассейна в соответствующую колбу культуры ткани.
5. Установите и затяните крышку культуры колбу.
6. Положите культуры колбы квартира на шейкере в течение 5 минут (комнатной температуры) на 35-40 оборотов в минуту.
7. Возвращение 20 колб культуры тканей в вертикальное положение в стойке и место в BSC.
8. Uncapping 3 колбы культуры ткани в одно время, обойтись 4 мл питательной среды в каждой колбе использованием серологических пипеток; заменить колпачки.
9. Будьте уверены, что кончик пипетки не свяжется с шеи культуры колбу или губы. Изменение наконечники по мере необходимости, если происходит контакт с колбу.
10. Инкубируют культуры тканей колбах при 37 ° C, 5% СО _2.

6. Скрининг Веро клетки для роста вируса

1. Экран прививку колбы культуры тканей на наличие признаков вирусной инфекции, цитопатический эффект (ЦПЭ), от 3-7 дней после заражения.
2. Осмотрите клеточных культур для CPE и / или загрязнения, наклоняя колб и изучения СМИ, что бассейны в нижней части колбы. СМИ появится облачно, как клетки ухудшаться во время CPE или за счет роста дрожжей, грибов, или бактериального заражения.
3. Пересмотреть культурах клеток, которые обладают облачно СМИ под инвертированным микроскопом. Вирусы заставит клетки деформируются и вырваться из культуры колб. Клеточные культуры с видимыми загрязняющих веществ, например, дрожжи, других бактерий, грибков или тяжелого мусора комаров, которые повторное тестирование, передавая исходный пул комара через 0.22μM фильтр шприца.
4. Асептических обойтись 1-2 мл СМИ от вируса-позитивных клеточных культур в подписанные cryotubes использованием серологических пипетки.
5. Вирус культур хранятся при температуре -80 ° C до идентифицируются с помощью соответствующих диагностических тестов.

7. Подготовка реагентов

1. MEM, 5% FBS. Растворите 37,6 г порошкообразного MEM в конечный объем 4 л дд H ₂ 0. Разлить раствор в 500 мл аликвоты в бутылках СМИ и автоклав. Когда раствор остынет, добавить асептически 26 мл тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 5,2 мл L-глутамина, 5,2 мл anti-biotic/mycotic и 10,4 мл 7,5% бикарбоната натрия в каждой бутылке. Хранить при температуре 4 ° С.
2. PBS-G. Растворить 16 г хлористого натрия, 0,4 г хлорида калия, 2,3 г Na ₂ HPO _4, 0,4 г KH ₂ PO ₄ и 4 мл 0,5% фенола красного в 1000 мл дд H ₂ 0. Отрегулируйте рН до 7.1-7.4 с 2 N NaOH (при необходимости). В отдельном стакане, тепло 600 мл H ₂ 0 до кипения. Удалить из горячей плиты, добавить 10 г желатина, и растворяются. Добавить растворенный желатин решение решение PBS и корректировать конечный объем до 2 л с дд H ₂ O. Добавьте 100 мл раствора в бутылках и автоклав. Когда раствор остынет, добавить асептически 42,8 мл тепла инактивированной сыворотки кролика и 1,4 мл anti-biotic/mycotic. Хранить при температуре 4 ° С.
3. PBS ячейки стирки. Добавьте 50 мл 10 раз PBS Дульбеко до 400 мл дд H ₂ O. Отрегулируйте рН до 7,1 с 2 н. Отрегулируйте конечный объем до 500 мл с дд H ₂ O. Фильтры решение с 0.2uM блок фильтра вакуума. Разлить в 5 мл аликвоты в 8 мл завинчивающейся крышкой трубки. Хранить при температуре 4 ° С.

8. Представитель Результаты

Девять различных вирусов из 4 семей таксономических были извлечены из комары, собранные в ходе непрерывного наблюдения по всему штату в Коннектикуте с 1997-2010 (таблица 1). Пять из этих вирусов, вызывающих заболевания человека, наиболее важных патогенов вирус Западного Нила и восточного лошадиного энцефалита. Новые открытия включают в себя: первое изоляции WNV от комаров, собранных вСеверной Америке в 1999 году ^2, первый изоляции Потоси вируса на северо-востоке США в 2000 году ^3, и первое изоляции Ла-Кроссе вируса в Новой Англии в 2005 году ^4.

Вирус	Семья	Количество изолятов	Количество мест	Количество лет обнаружены	Человека болезнь	Работах.
Вирус Западного Нила	Flaviviridae	1002	94	12	От умеренной до тяжелой, лихорадки, энцефалита	2,5
Вирус восточного конского энцефалита	Togaviridae	292	41	10	Тяжелая, энцефалит	6,7
Highlands J вирус	Togaviridae	178	39	11	Неизвестный	6
Джеймстаун Каньон вирус	Буньявирусов	305	74	14	От легкой до умеренной, лихорадка, менингит	8
Потоси вирус	Буньявирусов	259	76	4	Неизвестный	3
Кэш долине вирус	Буньявирусов	114	51	8	От легкой до тяжелой, лихорадка, неврологические болезни в двух документально подтвержденных случаев
Trivittatus вирус	Буньявирусов	83	21	11	Неизвестный
Ла-Кроссе вирус	Буньявирусов	1	1	1	От умеренной до тяжелой, энцефалит	4
Фландрия вирус	Rhabdoviridae	4	4	2	Неизвестный

Таблица 1. Вредоносные файлы, обнаруженные в поле, собранные от комаров Веро анализа культуры клеток. Комары были собраны во время наблюдения в штате Коннектикут с 1997-2010.

Обсуждение

Vero клеточной культуре анализа служит эффективным методом для скрининга поле, собранные комаров для разнообразия вирусов. Это контрастирует с молекулярными методами, которые специально направлены один или несколько вирусов, представляющих интерес. Более того, мы обнаружили, что Веро ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / оборудование	Компания	Номер в каталоге
Фетальной телячьей сыворотки	Гибко - Invitrogen	16140
Anti-biotic/mycotic	Гибко - Invitrogen	15240
Бикарбонат натрия NaHCO 3, 7,5% Soln.	Гибко - Invitrogen	25080
L-глютамин 200 мМ 100x	Гибко-Invitrogen	25030
Сухие минимальным необходимой среде (MEM)	Гибко - Invitrogen	11700
10X Дульбеко PBS	Гибко - Invitrogen	14080
Трипсин-EDTA	Гибко - Invitrogen	15400
Кролик сыворотке	Гибко - Invitrogen	16120
Клетки Vero (Clone E6)	АТСС	CRL-1586
Малый культуре ткани фляги, вентилируемые колпачки, 25 см 2	Falcon - Becton Dickinson	353112
Большой культуре ткани фляги, вентилируемые колпачки, 175 см 2	Falcon - Becton Dickinson	353108
Медно-покрытием ВВ, 4,5 мм	Crosman	0767
Вибрационная мельница	Retsch	MM300
Стойки Isopack морозильнике	Эппендорф	022510240